A large-scale screening system for self-cleaving ribozymes using structured RNA libraries

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本研究計画の最終年度である令和元年度では、自己切断活性の大規模解析による新種の自己切断型リボザイムの網羅的探索と検証実験のため、主に下記2つの課題に取り組んだ。結果的に、自己切断型リボザイム新規発見は達成できなかった。一方で研究課題の追求過程で確立した基盤技術群はRNAエレメント探索法として有用であり、一定の研究成果物は確立できた。これらの手法は、今後さらなる網羅性の拡大と感度の改善を行うことでリボザイムの探索へと繋げ得ると思料する。[課題1: ナノポアシーケンサーによる切断断片の検出]ショートリードを多く読めないという課題から定量性の問題が生じた。費用から得られる限りの現在の性能では十分な定量域に満たないことがわかった。加えて切断後の短い断片にポリAテールを付与すること、並びにアダプターを接合させる効率が低いことが問題として判明し、切断長でのバイアスを生じさせる原因となった。一方で、ショートリードのRNAを検出できるようにするライブラリ調整方法を確立した。[課題2: 構造プロービングによるRNAエレメントの探索]大規模並列ショートリードシーケンサーに立ち戻り、ライブラリ調整方法を検討した。その結果、デザインされたRNAを検出できるように改善したが、切断活性を有する新規自己切断型リボザイムは確認できなかった。次に、補因子の存在により切断活性が制御されている可能性を踏まえ、構造プロービングを補因子存在化で高次構造のスイッチングを評価する実験系を確立した。その結果、本研究にて行ったRNAデザインでは新規自己切断型リボザイムは確認できなかったが、特定領域における構造変化を検出した。また研究期間内では大規模探索の適用に至らなかったが、反応環境を細胞内に近づけるべく分子夾雑条件を検討し、高次構造の観点から反応条件の最適化をした。