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A large-scale screening system for self-cleaving ribozymes using structured RNA libraries

使用结构化 RNA 文库的大规模自切割核酶筛选系统

基本信息

批准号：
17J09014
负责人：
小松リチャード馨
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究計画の最終年度である令和元年度では、自己切断活性の大規模解析による新種の自己切断型リボザイムの網羅的探索と検証実験のため、主に下記2つの課題に取り組んだ。結果的に、自己切断型リボザイム新規発見は達成できなかった。一方で研究課題の追求過程で確立した基盤技術群はRNAエレメント探索法として有用であり、一定の研究成果物は確立できた。これらの手法は、今後さらなる網羅性の拡大と感度の改善を行うことでリボザイムの探索へと繋げ得ると思料する。[課題1: ナノポアシーケンサーによる切断断片の検出]ショートリードを多く読めないという課題から定量性の問題が生じた。費用から得られる限りの現在の性能では十分な定量域に満たないことがわかった。加えて切断後の短い断片にポリAテールを付与すること、並びにアダプターを接合させる効率が低いことが問題として判明し、切断長でのバイアスを生じさせる原因となった。一方で、ショートリードのRNAを検出できるようにするライブラリ調整方法を確立した。[課題2: 構造プロービングによるRNAエレメントの探索]大規模並列ショートリードシーケンサーに立ち戻り、ライブラリ調整方法を検討した。その結果、デザインされたRNAを検出できるように改善したが、切断活性を有する新規自己切断型リボザイムは確認できなかった。次に、補因子の存在により切断活性が制御されている可能性を踏まえ、構造プロービングを補因子存在化で高次構造のスイッチングを評価する実験系を確立した。その結果、本研究にて行ったRNAデザインでは新規自己切断型リボザイムは確認できなかったが、特定領域における構造変化を検出した。また研究期間内では大規模探索の適用に至らなかったが、反応環境を細胞内に近づけるべく分子夾雑条件を検討し、高次構造の観点から反応条件の最適化をした。

In this study, we plan to introduce the latest annual license and annual program, self-cut-off large-scale analysis, self-cut-off exploration of the new cut-off network, and focus on the next 2-year project. Results the results showed that the new rules and regulations of self-amputation were different from each other. One side of the research project aims to ensure the establishment of the basic technology group, the RNA technology group, the exploration method, and the results of the research. Use the gimmick, and in the future, the Internet gender awareness will be improved. You will be able to explore what you want. [topic 1: please tell us how to cut the fragment.] the problem is related to quantitative problems. The current performance limit is very high in the quantitative domain. After cutting off, the short fragments should be paid to the machine, and the joint temperature should be reduced. The problem should be determined, and the reason for the increase of temperature should be determined. On the other hand, please make sure that the whole method is correct. You may need to know that the RNA is correct. [topic 2: how to create a large scale model and list it in order to improve the overall performance of the RNA system. The results show that the RNA results show that there is a significant improvement in the activity of amputation, and that there are new rules for self-amputation. There are some factors in the secondary and secondary factors, such as the cutting activity, the possibility, the possibility, the existence and the existence of the factors. According to the results of this study, the new rules of the RNA system in this study confirm that there are significant changes in the performance of the system, and the results of this study show that the results of this study are based on the results of this study. in this study, the results of this study show that in this study, the results of this study are related to the results of this study. During the period of the study, large-scale exploration was carried out on a large scale. In the study period, the conditions for the use of large-scale models in the study period were studied in large-scale experiments, in the study period, in the study period.