液-液相分離を応用した抗体キャリアの開発及び抗体による細胞内分子制御への展開

应用液-液相分离的抗体载体的开发及其在使用抗体的细胞内分子控制中的应用

• 批准号: 22KJ1861
• 负责人: 岩田 恭宗
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1861/
• 关键词: ペプチド; 細胞内送達; タンパク質; 抗体; 液―液相分離

1．FcB(L17E)3による生体組織への抗体の導入法の検討現状では、FcB(L17E)3による抗体との液滴による抗体の細胞内送達は培養細胞への利用に限られている。膜傷害性ペプチド―抗体液滴の生体への応用可能性を検討する必要がある。そこで、まずは、FcB(L17E)3と負電荷性蛍光タンパク質である(-30)GFPを混合し、液滴を形成させ、それをマウス皮内に投与した。一部の細胞で(-30)GFPが細胞内に移行している様子を観察することができた。この結果により、FcB(L17E)3の生体への応用可能性が示唆された。今後の方針としては、担癌マウスの腫瘍への、膜傷害性ペプチド―抗体液滴による抗体送達が可能かを検討する。２．FcB(L17E)3と効果的に液滴を形成する負電荷抗体の検討FcB(L17E)3による蛍光標識抗体の液滴化と細胞内送達手法において、蛍光標識に代わる抗体の汎用的な負電荷修飾法の検討が必要である。まず、抗体結合ペプチドZ33のC末端を、Glu、PheまたはTyrで延長したペプチド数種類を作製した。このうちGluを多く含むペプチドがFcB(L17E)3と抗体存在下かつ高濃度の条件で緩衝液中に液滴を形成した。しかし、これらの溶液を培養細胞に添加できる濃度へ希釈すると、液滴はすべて崩壊した。原因として考えられるのは、負電荷がFc領域に集中していることである。そこで、ポリグルタミン酸を抗体のリジン側鎖に、架橋剤GMBSを用いて非特異的に修飾することを検討した。負電荷修飾抗体とFcB(L17E)3を緩衝液中で混合したところ、液滴形成は確認されなかった。原因として、蛍光標識抗体と異なり、液滴形成を静電相互作用のみに依存したことが考えられる。本研究の今後の方針としては、FcB(L17E)3と疎水性相互作用をするアミノ酸（PheやTyrなど）を含めたポリグルタミン酸の検討を行う。

1. The FcB (L17E) 3 に よ る living body tissue へ の import の antibodies の 検 status for で は, FcB (L17E) 3 に よ る antibody と の droplet に よ る antibody served は の cell culture cell へ の using に limit ら れ て い る. Membrane-damaging ペプチド - antibody droplet specimen へ 応 応 possibility of use を検 to する necessary がある. そ こ で, ま ず は, FcB (L17E) 3 と negative sexual 蛍 light タ ン パ ク qualitative で あ る (30) GFP を mixed し, droplet を form さ せ, そ れ を マ ウ ス intradermal に cast with し た. A で の cells (30) GFP に が cell migration し て い る others child を 観 examine す る こ と が で き た. The <s:1> results によ によ, and the FcB(L17E)3 organisms へ 応 are indicated by the possibility が for された. Future policy の と し て は, bear carcinoma マ ウ ス の swollen sores へ の, membrane damaging ペ プ チ ド - antibody droplet に よ る antibodies to が may か を beg す 検 る. 2. FcB (L17E) 3 と unseen fruit を に droplets formed す る negative antibody の 検 for FcB (L17E) 3 に よ る 蛍 light logo antibody の droplets change と intracellular delivery technique に お い て, 蛍 light logo に わ る antibody の domestic な negative modification method の 検 please が necessary で あ る. ま ず, antibody combining ペ プ チ ド Z33 の C terminal を, Glu, Phe ま た は Tyr で extended し た ペ プ チ ド several kinds を cropping し た. こ の う ち Glu を く more contain む ペ プ チ ド が FcB (L17E) 3 と antibody in the presence of か つ condition of high concentration の で を に droplets formed in the buffer し た. を し か し, こ れ ら の solution culture cell に add で き る concentration へ bush 釈 す る と, droplet は す べ て collapse 壊 し た. The reason is that と て て examines えられる <s:1> とである, negative charge がFc field に is concentrated て て る る とである とである とである. そ こ で, ポ リ グ ル タ ミ ン acid を antibody の リ ジ ン side lock に, bridging tonic GMBS を with い て nonspecific に modification す る こ と を beg し 検 た. Youdaoplaceholder2 mixing of negatively charged modified antibody とFcB(L17E)3を buffer たと たと ろ droplet formation されな confirmation されな たと った. Reason と し て, antibody と 蛍 light logo different な り, droplet formation を electrostatic interaction の み に dependent し た こ と が exam え ら れ る. の の policy in the future this study と し て は, FcB (L17E) 3 と 疎 water-based interaction を す る ア ミ ノ acid (Phe や Tyr な ど) contains を め た ポ リ グ ル タ ミ ン acid の う beg を 検 line.