成育医療における骨・靱帯の生分解性足場材料の探索と融合蛋白質の創製

在发育医学中寻找可生物降解的骨和韧带支架材料并创建融合蛋白

• 批准号: 24659506
• 负责人: 川北 敦夫
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: National Research Institute for Child Health and Development
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24659506/
• 关键词: キメラタンパク質; 細胞足場; BMP4; 骨形成

我々は細胞外マトリックスの代表的な細胞接着タンパクであるファイブロネクチンの持つコラーゲンへの高い結合性に注目した。本研究の目的は骨形成タンパクの一つであるBone morphogenic protein 4( BMP-4 )にファイブロネクチンのコラーゲン結合領域を融合させたキメラタンパクを作製し、コラーゲン複合化合成高分子担体へ結合させることで培養担体の持つ利点を生かしたまま、成長因子の供給も行うことのできるインテリジェント再生足場材料を開発することである。I. コラーゲン複合化合成高分子シートの作製として、生体吸収性合成高分子であるポリグリコール酸-ポリ乳酸共重合体(PLGA)からなるニットメッシュにアテロ化コラーゲンのマイクロスポンジを真空凍結乾燥法にて複合化させグルタールアルデヒド架橋を行った。メッシュの空隙をコラーゲンの網目で覆うことで細胞に対する親和性と表面積の増大を図った。キメラタンパクの作製として、ヒト正常細胞に発現するファイブロネクチンのmRNAを鋳型として増幅させた相捕的DNA遺伝子配列の中から既知であるコラーゲン結合領域の遺伝子配列（約1000塩基）を酵素処理にて切り出しを行った。同様に正常ヒト胎盤由来mRNAを鋳型として骨形成タンパク BMP-4の成熟型遺伝子配列（約400塩基）を抽出し、両者を連結したタンパク発現ベクターを作製した。また、シート上のキメラタンパク局在を生体外にて免疫組織学的に評価するとともに培養液中へのタンパク放出程度をファイブロネクチンの継時的なELISA法により推定した。キメラ化BMP-4の機能確認は培養未分化骨髄間質細胞へのキメラタンパクの添加および複合化シートへの細胞播種実験により、骨分化マーカー遺伝子の発現、alkaline phosphatase活性を測定した。

My 々は extracellular マトリックスの representative な cell then タンパクであるファイブロネクチンのholding つコラーゲンへの高い合性に Noticeした. The purpose of this study is: Bone morphogenic protein 4 (BMP-4) )にファイブロネクチンのコラーゲンcombination fieldをfusionさせたキメラMade of タンパクを, コラーゲン composite synthetic polymer carrier and bondedことでCultivate the body's advantageous points を生かしたまま、The supply of growth factors も行うIt is a recycled football field material. I.コラーゲン composite synthetic polymer シートのとして, bioabsorbable synthetic polymer であるポリグリコール acid-Polactic acid copolymer (PLGA)からなるットメッシュにアテロ化コラーゲンのマイクロスポンジをVacuum freeze-drying method is used for compounding and bridging. The メッシュのgap をコラーゲンの mesh ででことで cells に対する affinity と surface area の increase を図った. The production of キメラタンパクのとして, ヒトNormal Cell に発appears するファDN of イブロネクチンのmRNAを鋳 type としてincreased させたphase A. The combination of the known であるコラーゲン and the の伝子array (approximately 1,000 base) is an enzyme-processed にてcut り出しを行った. Same as the origin of normal placenta, mRNA, type, bone formation, and bone formation. The mature type of BMP-4 is a combination of mature components (approximately 400 base), extracted and connected, and produced by the company.また, シート上のキメラタンパク bureau in を in vitro にて immunohistology に evaluation 価 するとともに culture The ELISA method can be used to estimate the degree of release of fluorescein in liquid. Confirmation of the function of キメラ BMP-4 and culture of undifferentiated bone marrow mesenchymal cells and addition of キメラタンパクのComposite cell seeding, bone differentiation, alkaline Phosphatase activity was measured.