光る透明ガエルの作出：非モデル両生類への遺伝子導入法の確立とNGSによる発現解析

发光透明青蛙的创造：非模型两栖动物基因导入方法的建立及NGS表达分析

• 批准号: 25640050
• 负责人: 住田 正幸
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25640050/
• 关键词: 透明ガエル; 色彩突然変異; 色素細胞; 遺伝子導入; 非モデル動物; トランスクリプトーム解析; 次世代シークエンサ; 光る透明ガエル

1.ニホンアカガエルの灰色眼と黒色眼の２つの色彩突然変異を用いて、皮膚が透明で内臓が透けて見える透明ガエルを効率的に作製し、その遺伝様式を明らかにした。透明ガエルの作製には灰色眼♀×野生型(ヘテロ)♂の交配が最も効率的であった。また、透明ガエルの皮膚の微細構造を調べるため、真皮色素細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、野生型では黄色、虹色、黒色の色素細胞が層状に観察されたが、透明ガエルでは色素細胞の数が少なく、未熟な黄色素胞様の細胞だけが見られた。2.I-SceI を用いたツメガエルの遺伝子導入法をニホンアカガエルに適用するため、顕微注入法の条件検討を行った。インジェクション効率および遺伝子導入効率の評価には赤色蛍光タンパク質mCherry mRNAとEF1αプロモーター連結EGFP/I-SceIベクターを用いた。その結果、受精卵に顕微注入した2日後に mCherry を発現した胞胚が得られた。3.透明ガエルについて色素細胞の変異をもたらす責任遺伝子を同定するため、次世代シークエンサを用いて皮膚から抽出したmRNAの塩基配列を決定し、得られた配列群を利用して皮膚の遺伝子発現プロファイルを構築するとともに、それぞれの遺伝子発現量の比較を行った。実験には野生型、黒色眼、灰色眼および透明ガエルを用いた。これらの皮膚RNAを抽出し、cDNAライブラリ作成、シークエンスを行った。その結果、合計約30Gbpの塩基配列を得た。これらについてアセンブラを用いてコンティグ配列を構築したところ、約23万の遺伝子配列が出力された。このコンティグ配列に各サンプルのリードをマッピングし、各遺伝子にマップされたリード数を統計的手法により群間比較したところ、黒色眼と透明ガエルでは1238、灰色眼と透明ガエルでは387の発現変動遺伝子が検出された。遺伝子ネットワーク解析の結果、前者ではアミノ酸生合成経路、後者ではホルモン刺激などに関わる遺伝子群との関連性が示唆された。

1. The color of gray eyes and black eyes suddenly changes. The skin is transparent. The inner part is transparent. The effect is controlled. The transmission pattern is clear. The most common type is the wild type (wild type). The fine structure of the transparent skin is modulated, and the pigment cells of the dermis are observed by electron microscope. The number of pigment cells in yellow, rainbow and black in wild-type is small, and the number of immature pigment cells in yellow is small. 2.I-SceI is used to investigate the conditions for microinjection. Evaluation of the efficiency of gene introduction in the presence of EGFP/I-SceI 2 days after microinjection, mCherry appeared and embryos were obtained. 3. To determine the gene expression pattern of transparent pigment cells, and to compare the gene expression pattern of the next generation of pigment cells. Wild type, black eye, gray eye and transparent eye DNA extraction, cDNA extraction, DNA sequencing The results were approximately 30Gbp in total. About 230,000 employees of the company contributed to the construction of the company. The number of different groups of people is compared. Black eyes and transparent eyes are 1238. Gray eyes and transparent eyes are 387. The number of different groups of people is compared. The results of the analysis of the gene expression patterns show that the former is not related to the acid synthesis pathway, while the latter is related to the gene expression patterns.

项目成果

Development and characterization of new microsatellite loci in the Otton frog (Babina subaspera) and cross-amplification in a congeneric species, Holst’s frog (B. holsti).

奥顿蛙 (Babina subaspera) 中新微卫星位点的开发和表征以及同属物种霍尔斯特蛙 (B. holsti) 中的交叉扩增。

• DOI: 10.1007/s12686-013-9981-x
• 发表时间: 2013
• 期刊: Conservation Genetics Resources
• 影响因子: 1.1
• 作者: Ryosuke Kakehashi;Takeshi Igawa;Noriko Iwai;Etsuko Shoda-Kagaya;and Masayuki Sumida
• 通讯作者: and Masayuki Sumida

Inter- and intra-island divergence in Odorrana ishikawae (Anura, Ranidae) of the Ryukyu Archipelago of Japan, with description of a new species

日本琉球群岛 Odorrana ishikawae（无尾蛇科，Ranidae）的岛内和岛内分化，以及新物种的描述

• 发表时间: 2014
• 作者: Kuramoto;M.;N. Satou;S. Oumi;A. Kurabayashi;and M. Sumida
• 通讯作者: and M. Sumida

Genetic divergence and geographic distribution of frogs in genus Fejervarya from Indonesia from mitochondrial 16S rRNA gene analysis

线粒体16S rRNA基因分析印度尼西亚Fejervarya蛙的遗传分化和地理分布

• 发表时间: 2014
• 期刊: Treubia
• 作者: Kurniawan;N.;T. H. Djong;T. Maideliza;A. Hamidy;M. Hasan;T. Igawa and M. Sumida
• 通讯作者: T. Igawa and M. Sumida

両生類「ノアの方舟」プロジェクト-両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み-

两栖动物“诺亚方舟”计划 - 通过圈养繁殖濒危两栖动物的尝试 -

• 发表时间: 2014
• 期刊: 生物工学会誌
• 作者: Kurniawan;N.;T. H. Djong;T. Maideliza;A. Hamidy;M. Hasan;T. Igawa and M. Sumida;住田正幸
• 通讯作者: 住田正幸

東アジア産トノサマガエル種群の遺伝子浸透

东亚树蛙物种组的基因渗透

• 发表时间: 2014
• 作者: Mohammed Mafizul Islam;Ryosuke Kakehashi;Oumi Sohei;Katsuren;Atsushi Kurabayashi;Masayuki Sumida;倉林 敦・住田正幸・大島一彦・Miguel Vences;小巻翔平・井川 武・林 思民・東城幸治・Min-Mi-Sook・住田正幸
• 通讯作者: 小巻翔平・井川 武・林 思民・東城幸治・Min-Mi-Sook・住田正幸