蛍光性高飽和磁化ナノ粒子を用いたリソソームの迅速単離技術の開発

本研究でリソソームの磁気分離プローブとして利用する予定であった高飽和磁化Fe/FexOyナノ粒子は、合成に必要な試薬である鉄ペンタカルボニルの入手が困難となり、Fe/FexOyナノ粒子の創製を断念した。しかし、これまでに使用したAg/FeCo/Agコア/シェル/シェルナノ粒子は、毒性が低く、リソソームの磁気分離に利用可能なプローブであることが示されたため(ACS Nano 2022, 16, 885)、引き続き同ナノ粒子を用いて検討を続けた。2022年度は、磁気分離を行う細胞の選択および遺伝子改変を行った。具体的には、リソソーム病の一つであるバッテン病に関連するタンパク質CLN3をノックアウト(KO)したHEK293細胞と、野生株のHEK293細胞を比較することにした。CLN3をKOするため、CRISPR-Cas9を使って遺伝子改変を行い、CLN3をコードする遺伝子の1塩基欠損型と10塩基欠損型の細胞株の作製に成功した。これらの細胞株では野生株と比べ、小さいリソソームの数が増えていることが共焦点顕微鏡観察の結果分かった。これがCLN3のKOによる効果かを検証するために、欠損遺伝子を回復させるレスキュー実験を試みた。しかし、CLN3のKOが成功しているかを調べるための分かりやすい表現型がなく、またCLN3のウエスタンブロットではKO細胞からもCLN3が検出されるため、評価が難しいことから、CLN3 KO細胞をリソソームの磁気分離の対象細胞とすることを断念した。新たな対象細胞として、リソソーム病の一つであるニーマンピック病C1に関連するタンパク質NPC1をKOしたMEF細胞とその野生株を比較することにした。

本研究でリソソームの磁気分離プローブとして利用する予定であった高飽和磁化Fe/FexOyナノ粒子は、合成に必要な試薬である鉄ペンタカルボニルの入手が困難となり、Fe/FexOyナノ粒子の創製を断念した。しかし、これまでに使用したAg/FeCo/Agコア/シェル/シェルナノ粒子は、毒性が低く、リソソームの磁気分離に利用可能なプローブであることが示されたため(ACS Nano 2022, 16, 885)、引き続き同ナノ粒子を用いて検討を続けた。2022年度は、磁気分離を行う細胞の選択および遺伝子改変を行った。具体的には、リソソーム病の一つであるバッテン病に関連するタンパク質CLN3をノックアウト(KO)したHEK293細胞と、野生株のHEK293細胞を比較することにした。CLN3をKOするため、CRISPR-Cas9を使って遺伝子改変を行い、CLN3をコードする遺伝子の1塩基欠損型と10塩基欠損型の細胞株の作製に成功した。これらの細胞株では野生株と比べ、小さいリソソームの数が増えていることが共焦点顕微鏡観察の結果分かった。これがCLN3のKOによる効果かを検証するために、欠損遺伝子を回復させるレスキュー実験を試みた。しかし、CLN3のKOが成功しているかを調べるための分かりやすい表現型がなく、またCLN3のウエスタンブロットではKO細胞からもCLN3が検出されるため、評価が難しいことから、CLN3 KO細胞をリソソームの磁気分離の対象細胞とすることを断念した。新たな対象細胞として、リソソーム病の一つであるニーマンピック病C1に関連するタンパク質NPC1をKOしたMEF細胞とその野生株を比較することにした。