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蛍光性高飽和磁化ナノ粒子を用いたリソソームの迅速単離技術の開発

利用荧光高饱和磁化纳米粒子开发溶酶体快速分离技术

基本信息

批准号：
21K14506
负责人：
高橋麻里
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究でリソソームの磁気分離プローブとして利用する予定であった高飽和磁化Fe/FexOyナノ粒子は、合成に必要な試薬である鉄ペンタカルボニルの入手が困難となり、Fe/FexOyナノ粒子の創製を断念した。しかし、これまでに使用したAg/FeCo/Agコア/シェル/シェルナノ粒子は、毒性が低く、リソソームの磁気分離に利用可能なプローブであることが示されたため(ACS Nano 2022, 16, 885)、引き続き同ナノ粒子を用いて検討を続けた。2022年度は、磁気分離を行う細胞の選択および遺伝子改変を行った。具体的には、リソソーム病の一つであるバッテン病に関連するタンパク質CLN3をノックアウト(KO)したHEK293細胞と、野生株のHEK293細胞を比較することにした。CLN3をKOするため、CRISPR-Cas9を使って遺伝子改変を行い、CLN3をコードする遺伝子の1塩基欠損型と10塩基欠損型の細胞株の作製に成功した。これらの細胞株では野生株と比べ、小さいリソソームの数が増えていることが共焦点顕微鏡観察の結果分かった。これがCLN3のKOによる効果かを検証するために、欠損遺伝子を回復させるレスキュー実験を試みた。しかし、CLN3のKOが成功しているかを調べるための分かりやすい表現型がなく、またCLN3のウエスタンブロットではKO細胞からもCLN3が検出されるため、評価が難しいことから、CLN3 KO細胞をリソソームの磁気分離の対象細胞とすることを断念した。新たな対象細胞として、リソソーム病の一つであるニーマンピック病C1に関連するタンパク質NPC1をKOしたMEF細胞とその野生株を比較することにした。

In this paper, we study the magnetic separation and utilization of Fe/FexOy particles with high saturation magnetization, and the creation of Fe/FexOy particles. The use of Ag/FeCo/Ag particles in this field is of low toxicity, and magnetic separation is of good quality.(ACS Nano 2022, 16, 885). The use of Ag/FeCo particles in this field is discussed. In 2022, the magnetic separation process was carried out. The specific expression of HEK293 cells was compared with that of wild strain HEK293 cells. The cell lines of CLN3, CRISPR-Cas9 and CLN3 were successfully produced. The results of confocal microscopical observation were analyzed. This is the first time I've ever seen a woman who's been in a coma. CLN3 KO cells were successfully isolated from CLN3 cells and the phenotype of CLN3 cells was determined. The new strain is called MEF. The new strain is called MEF.