Elucidation of the mechanism of pathogenicity of Rhodococcus equi in ruminants and establishment of a diagnostic method

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前年度の研究より、VapN発現にはvapNアンチセンス鎖（AS鎖）RNAによる発現制御が関与することを見出した。そこでAS鎖プロモーター配列を用いたDNAプルダウンを行い、本領域に特異的に結合する転写制御因子の特定を試みた結果、転写制御因子してGntRが同定された。続いて、非産生株のgntR欠損株及び補完株を作出した。gntR欠損株においてVapN発現が増加し、補完株でその発現が減少した。さらに、AS鎖プロモーター活性は、gntR欠損株において野生株と比較して有意に減少し、補完株で野生株と同程度まで活性が戻った。すなわち、VapN発現において、GntRによるAS鎖RNA発現を介した抑制機構が存在することが示唆された。前年度作出した抗VapNモノクローナル抗体を用いて、VapN産生株を感染させたマウスの免疫染色を行った結果、肝臓、脾臓の壊死性病変に陽性反応が認められた。また、VapN陽性R. equiに感染したと推定されるヤギおよびウシの免疫染色では、肺、リンパ節、肋骨などの壊死病変を有する臓器で陽性反応が認められた。本抗体を用いた免疫学的診断法は、類症鑑別やこれまで見逃されていた症例の特定に利用できる。また、本年度は自家生物発光を利用した病原性評価法の改良を行った。恒常発現プロモーターにluxABCDEをつなぎ、各種R. equi株に導入したところ、化学発光を検出し、菌数と発光強度に相関が認められた。また、それらの形質転換体を培養マクロファージに感染させた場合、細胞内で増殖可能な強毒株由来の形質転換体で発光を検出した。続いて、IVISを用いてマウス生体内における増殖性を検討した結果、強毒株由来の形質転換体では、投与3日後に肝臓と脾臓に発光を検出した。以上より、本自家発光株は、R. equiの病原性解析を強化するものと考えられる。