糖代謝制御の分子機構の解明に向けた代謝産物センサータンパク質の構造解析

代谢传感器蛋白的结构分析，阐明葡萄糖代谢控制的分子机制

• 批准号: 21K15034
• 负责人: 大志田 達也
• 金额: $ 3万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15034/
• 关键词: タンパク質精製; 結晶化; X線回折; 転写因子; 転写制御因子; 糖尿病; 構造生物学

当該タンパク質(CtBP2)と転写因子(FOXO1)の複合体構造解析の第一歩として、まずCtBP2単体の発現、構築、精製及び結晶化を行った。N末端にGSTタグ及びHRV 3C配列を付加したヒト由来CtBP2の大腸菌による大量発現に成功した。GSTアフィニティーカラムに吸着させた後、PreScission ProteaseでGSTを切断し、その後陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製した。これを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、良質な結晶は得られなかった。そこで、二次構造予測からN末端及びC末端付近のdisorder領域と推定された部分を除去したコンストラクトを用いて、同様の手順で発現、精製及び結晶化スクリーニングを行った。条件検討の結果，0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mmの単結晶を獲得した。得られた結晶を用いてX線回折実験を行い、PDB ID: 2OMEをモデルにした分子置換法によって構造を決定した。解析の結果、CtBP2は結晶中で四量体を形成しており、結晶化の際に加えていないのにも関わらずNADが結合していた。CtBP2とFOXO1の複合体構造解析を行うため、完全長FOXO1の大腸菌による発現系の構築を試みたが、発現は認められなかった。そこで完全長配列ではなく、ペプチドベースでの複合体構造取得を目指し、検討中である。

When the CtBP2 (CtBP2) writing factor (FOXO1) complex is used to analyze the first component, the CtBP2 system is used to analyze, analyze, refine, and crystallize the results. The N-terminal "GST" and "HRV 3C" were arranged to increase the number of CtBP2 bacteria and a large number of successful ones were found. After the GST was inhaled, the PreScission Protease was cut off and the GST was cut off after the inhalation, and after that, the doctor passed the test. In this paper, we use the crystallization method to improve the performance of the system, and then use the crystallization results to obtain the results. Both the N-terminal and the C-terminal of the device are presumed to be close to the disorder field. This section removes the information on the device, and the computer. The results of conditional temperature tests show that 0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mm results show satisfactory results. The result of the experiment was determined by using the X-ray back-analysis method and the molecular method of PDB ID: 2OME. Analysis of the results, CtBP2 results in the formation of four quaternary samples, crystallization and crystallization. The results show that the NAD is combined with the results of the analysis of the results and the results. The CtBP2-FOXO1 complex was constructed and analyzed, and the full-length FOXO1 bacteria were isolated and analyzed. In this system, the complete configuration of the complex is completed, and the target is obtained by the construction of the complex.