糖代謝制御の分子機構の解明に向けた代謝産物センサータンパク質の構造解析

代谢传感器蛋白的结构分析，阐明葡萄糖代谢控制的分子机制

• 批准号: 21K15034
• 负责人: 大志田 達也
• 金额: $ 3万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15034/
• 关键词: タンパク質精製; 結晶化; X線回折; 転写因子; 転写制御因子; 糖尿病; 構造生物学

当該タンパク質(CtBP2)と転写因子(FOXO1)の複合体構造解析の第一歩として、まずCtBP2単体の発現、構築、精製及び結晶化を行った。N末端にGSTタグ及びHRV 3C配列を付加したヒト由来CtBP2の大腸菌による大量発現に成功した。GSTアフィニティーカラムに吸着させた後、PreScission ProteaseでGSTを切断し、その後陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製した。これを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、良質な結晶は得られなかった。そこで、二次構造予測からN末端及びC末端付近のdisorder領域と推定された部分を除去したコンストラクトを用いて、同様の手順で発現、精製及び結晶化スクリーニングを行った。条件検討の結果，0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mmの単結晶を獲得した。得られた結晶を用いてX線回折実験を行い、PDB ID: 2OMEをモデルにした分子置換法によって構造を決定した。解析の結果、CtBP2は結晶中で四量体を形成しており、結晶化の際に加えていないのにも関わらずNADが結合していた。CtBP2とFOXO1の複合体構造解析を行うため、完全長FOXO1の大腸菌による発現系の構築を試みたが、発現は認められなかった。そこで完全長配列ではなく、ペプチドベースでの複合体構造取得を目指し、検討中である。

作为对蛋白质复杂结构（CTBP2）和转录因子（FOXO1）的复杂结构的第一步，仅首先表达，构造，纯化和结晶。大肠杆菌成功表达了N端添加了GST标签和HRV 3C序列的人体CTBP2。吸附在GST亲和力柱上后，用预缩蛋白酶切割GST，然后在阴离子交换柱和凝胶过滤柱上纯化。这用于进行结晶筛选，但没有获得高质量的晶体。因此，使用一种构造，在二级结构预测中除去了N末端和C末端附近的疾病区域和估计部分的构建体进行表达，纯化和结晶筛选。由于条件研究，获得了0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mm的单晶。使用获得的晶体进行X射线衍射实验，并通过以PDB ID：2ome建模的分子替代方法确定结构。分析表明，CTBP2在晶体中形成四聚体，即使在结晶过程中未添加NAD，NAD也是结合的。为了分析CTBP2和FOXO1的复杂结构，我们尝试使用大肠杆菌为全长FOXO1构建表达系统，但未观察到表达。因此，我们目前正在考虑基于肽而不是全长序列获得复杂结构的目的。