糖代謝制御の分子機構の解明に向けた代謝産物センサータンパク質の構造解析

代谢传感器蛋白的结构分析，阐明葡萄糖代谢控制的分子机制

• 批准号: 21K15034
• 负责人: 大志田 達也
• 金额: $ 3万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15034/
• 关键词: タンパク質精製; 結晶化; X線回折; 転写因子; 転写制御因子; 糖尿病; 構造生物学

当該タンパク質(CtBP2)と転写因子(FOXO1)の複合体構造解析の第一歩として、まずCtBP2単体の発現、構築、精製及び結晶化を行った。N末端にGSTタグ及びHRV 3C配列を付加したヒト由来CtBP2の大腸菌による大量発現に成功した。GSTアフィニティーカラムに吸着させた後、PreScission ProteaseでGSTを切断し、その後陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製した。これを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、良質な結晶は得られなかった。そこで、二次構造予測からN末端及びC末端付近のdisorder領域と推定された部分を除去したコンストラクトを用いて、同様の手順で発現、精製及び結晶化スクリーニングを行った。条件検討の結果，0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mmの単結晶を獲得した。得られた結晶を用いてX線回折実験を行い、PDB ID: 2OMEをモデルにした分子置換法によって構造を決定した。解析の結果、CtBP2は結晶中で四量体を形成しており、結晶化の際に加えていないのにも関わらずNADが結合していた。CtBP2とFOXO1の複合体構造解析を行うため、完全長FOXO1の大腸菌による発現系の構築を試みたが、発現は認められなかった。そこで完全長配列ではなく、ペプチドベースでの複合体構造取得を目指し、検討中である。

When the タ ン パ ク mass (CtBP2) と planning write factor (FOXO1) の complex structure の first step と し て, ま ず CtBP2 単 body の 発 now, building, refining and び crystallization を line っ た. N terminal に GST タ グ and び HRV 3 c match column を plus し た ヒ ト origin CtBP2 の coliform に よ る large 発 に success now し た. GST ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に sorption さ せ た, PreScission Protease で GST を cut し, そ の after Yin イ オ ン exchange カ ラ ム, ゲ ル ろ too カ ラ ム で refined し た. こ れ を with い て crystallization ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た が, good quality な crystallization は ら れ な か っ た. そ こ で, secondary structure can be か ら び C and N end end paying nearly の disorder field と presumption さ れ た part を remove し た コ ン ス ト ラ ク ト を with い て, with others in の hand shun で 発 now, refined and び crystallization ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. The condition 検 obtained the <s:1> result, 0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mm <s:1> 単 crystallization を obtained た た. Have ら れ た crystallization を with い て X-ray inflexion be 験 を い, PDB ID: 2 ome を モ デ ル に し た molecular displacement method に よ っ て tectonic を decided し た. Analytical の results, CtBP2 は を で four quantity body formation in crystallization し て お り, crystallization の interstate に plus え て い な い の に も masato わ ら ず NAD が combining し て い た. CtBP2 と FOXO1 の complex tectonic line analytical を う た め, long completely FOXO1 の coliform に よ る 発 try now is の build を み た が, 発 now は め ら れ な か っ た. そ こ で completely with long column で は な く, ペ プ チ ド ベ ー ス で の complex structure obtained を refers し, beg the 検 で あ る.