糖代謝制御の分子機構の解明に向けた代謝産物センサータンパク質の構造解析

代谢传感器蛋白的结构分析，阐明葡萄糖代谢控制的分子机制

• 批准号: 21K15034
• 负责人: 大志田 達也
• 金额: $ 3万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15034/
• 关键词: タンパク質精製; 結晶化; X線回折; 転写因子; 転写制御因子; 糖尿病; 構造生物学

当該タンパク質(CtBP2)と転写因子(FOXO1)の複合体構造解析の第一歩として、まずCtBP2単体の発現、構築、精製及び結晶化を行った。N末端にGSTタグ及びHRV 3C配列を付加したヒト由来CtBP2の大腸菌による大量発現に成功した。GSTアフィニティーカラムに吸着させた後、PreScission ProteaseでGSTを切断し、その後陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製した。これを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、良質な結晶は得られなかった。そこで、二次構造予測からN末端及びC末端付近のdisorder領域と推定された部分を除去したコンストラクトを用いて、同様の手順で発現、精製及び結晶化スクリーニングを行った。条件検討の結果，0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mmの単結晶を獲得した。得られた結晶を用いてX線回折実験を行い、PDB ID: 2OMEをモデルにした分子置換法によって構造を決定した。解析の結果、CtBP2は結晶中で四量体を形成しており、結晶化の際に加えていないのにも関わらずNADが結合していた。CtBP2とFOXO1の複合体構造解析を行うため、完全長FOXO1の大腸菌による発現系の構築を試みたが、発現は認められなかった。そこで完全長配列ではなく、ペプチドベースでの複合体構造取得を目指し、検討中である。

The first step of structural analysis of the complex of CtBP2 and FOXO1 is to develop, construct, refine and crystallize CtBP2 monomer. N-terminal GST and HRV 3C sequences were successfully identified in large quantities due to the presence of CtBP2 in Escherichia coli. GST is cut off, pre-scission protected and refined. This is the first time that I've ever seen such a thing. Disorder regions near the N and C termini are predicted to be removed from the secondary structure, and the same process is developed, refined, and crystallized. As a result of the conditional investigation, 0.1 mm x 0.1 mm x 0.2 mm crystals were obtained. The structure of the crystal was determined by X-ray diffraction, PDB ID: 2OME. The analysis results show that CtBP2 crystallizes in the form of tetrahedra, and crystallizes in the form of NAD. The structural analysis of the complex of CtBP2 and FOXO1 has been carried out, and the construction of the discovery system for the complete growth of FOXO1 in E. coli has been tried and tested, and the discovery has been confirmed. The structure of the complex is obtained by complete long alignment.