Development of simultaneous ultra-fast 3D super resolution imaging and 3D single molecule tracking microscope system

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本研究では超高速3D超解像イメージング技術を開発し、それを用いてシナプスの群島構造を解明することを目的としている。前年度までには顕微鏡の検出光路にシリンドリカルレンズを挿入し、その性能評価を行った。その結果、適切な曲率をもつシリンドリカルレンズを使用することにより、XY方向の位置決定精度が30nm程度、Z方向の位置決定精度が60nm程度の正確性をもって１分子蛍光追跡が可能となった。本年度ではさらに広範囲のZ方向への追跡を可能とするため、液体レンズを用いた高速Zスキャンのセットアップを行なった。まず、特注のサンプルホルダーを用いて、対物レンズとレボルバーの間に液体レンズユニットを挿入した状態でサンプルを固定できるように工夫し、観察時のサンプルドリフトを数nm以下に抑えられるようにした。液体レンズの焦点距離はアナログ電圧信号によって制御が可能なので、自作の顕微鏡制御システムを用いて、信号ボードからのアナログ制御が可能なようにセットアップした。さらに観察フレーム単位での同期を可能とするため、カメラ制御信号との同期を可能とするソフトウェアの開発も行なった。さらにシナプスの群島構造、軸索でのアクチンリング構造を可視化するため、神経細胞の培養方法の最適化も検討した。通常、神経細胞の分散培養ではある程度の細胞密度がないと正常な神経細胞の成熟が阻害されるが、群島構造やリング構造の可視化のためには低密度培養が必須となる。共培養するグリア細胞の密度や、培養液の最適化を試験し、最終的に通常の高密度培養で１週間培養した培地を再利用する、コンディションドメディウムを用いた手法によって、通常の５倍程度まで密度を減らしても通常と同等の成熟が見られることが分かった。来年度からは実際にセットアップしたシステムを用いて、最適化した神経細胞の観察を行なっていく予定である。