Development of simultaneous ultra-fast 3D super resolution imaging and 3D single molecule tracking microscope system

同步超快速3D超分辨率成像和3D单分子跟踪显微镜系统的开发

• 批准号: 21K15058
• 负责人: 角山 貴昭
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15058/
• 关键词: 1分子蛍光顕微鏡法; 3次元超解像顕微鏡法; 神経シナプス; 神経受容体; 3次元蛍光１分子追跡; 超解像顕微鏡法; シナプス; 群島構造

本研究では超高速3D超解像イメージング技術を開発し、それを用いてシナプスの群島構造を解明することを目的としている。前年度までには顕微鏡の検出光路にシリンドリカルレンズを挿入し、その性能評価を行った。その結果、適切な曲率をもつシリンドリカルレンズを使用することにより、XY方向の位置決定精度が30nm程度、Z方向の位置決定精度が60nm程度の正確性をもって１分子蛍光追跡が可能となった。本年度ではさらに広範囲のZ方向への追跡を可能とするため、液体レンズを用いた高速Zスキャンのセットアップを行なった。まず、特注のサンプルホルダーを用いて、対物レンズとレボルバーの間に液体レンズユニットを挿入した状態でサンプルを固定できるように工夫し、観察時のサンプルドリフトを数nm以下に抑えられるようにした。液体レンズの焦点距離はアナログ電圧信号によって制御が可能なので、自作の顕微鏡制御システムを用いて、信号ボードからのアナログ制御が可能なようにセットアップした。さらに観察フレーム単位での同期を可能とするため、カメラ制御信号との同期を可能とするソフトウェアの開発も行なった。さらにシナプスの群島構造、軸索でのアクチンリング構造を可視化するため、神経細胞の培養方法の最適化も検討した。通常、神経細胞の分散培養ではある程度の細胞密度がないと正常な神経細胞の成熟が阻害されるが、群島構造やリング構造の可視化のためには低密度培養が必須となる。共培養するグリア細胞の密度や、培養液の最適化を試験し、最終的に通常の高密度培養で１週間培養した培地を再利用する、コンディションドメディウムを用いた手法によって、通常の５倍程度まで密度を減らしても通常と同等の成熟が見られることが分かった。来年度からは実際にセットアップしたシステムを用いて、最適化した神経細胞の観察を行なっていく予定である。

这项研究旨在开发超高速度3D超分辨率成像技术，并使用它来阐明突触群岛的群岛结构。到上一年，将圆柱形镜头插入了显微镜的检测光路径，并评估了其性能。结果，通过使用适当曲率的圆柱形镜头，单分子荧光跟踪可以在XY方向上精确地缩短约30 nm，在z方向上约为60 nm。今年，我们使用液态镜头建立了一个高速Z扫描，以在z方向上进行跟踪甚至更宽的范围。首先，使用定制的样品持有人，可以将样品与物镜镜头和左轮手枪之间的液态透镜单元固定，从而使样品在观察过程中保持样品漂移至几nm或更少。液态晶状体的焦距可以通过模拟电压信号控制，因此使用自制显微镜控制系统，我们设置了系统，以便可以实现信号板的模拟控制。此外，为了按照框架启用同步，还开发了与摄像机控制信号同步的软件。此外，我们还研究了神经元培养方法的优化，以可视化轴突中突触和肌动蛋白环结构的群岛结构。通常，在神经元的分散培养物中，如果没有某些细胞密度，则抑制正常的神经元成熟，但低密度培养对于可视化群岛和环结构至关重要。已经发现，即使密度降低到通常是通常的五倍，即使通过测试神经胶质细胞的密度和培养基的优化，也可以看到与正常的相同成熟，并最终重用在正常的高密度培养中培养的培养基一周。从明年开始，我们计划使用实际设置的系统观察优化的神经元。

项目成果

Nanoscale LLPS-based liquid-like signaling platform that cooperatively integrates RTK, GPCR, and GPI-anchored receptor signals

基于纳米级 LLPS 的液体信号平台，协同集成 RTK、GPCR 和 GPI 锚定受体信号

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuta Suzuki;Tak-aki Tsunoyama;Tak-aki Tsunoyama
• 通讯作者: Tak-aki Tsunoyama

Nanoscale condensed liquid platform on the plasma membrane for signal integration

质膜上的纳米级凝聚液体平台用于信号集成

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuta Suzuki;Tak-aki Tsunoyama
• 通讯作者: Tak-aki Tsunoyama