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Exploration of adjuvant-active substances derived from extracellular membrane vesicles

细胞外膜囊泡来源的佐剂活性物质的探索

基本信息

批准号：
21K15254
负责人：
河野健一
金额：
$ 3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

様々な細胞から恒常的に分泌される細胞外小胞(EV)の生物学的意義は長らく不明とされてきた。近年の研究で、EVには免疫細胞を活性化させる効果があると分かってきたが、細胞のEV取込み機構やEVの内包物放出機構、そして免疫活性中心の物質情報に関して、分子レベルでの解析データは極めて限られている。本研究では、EVによる細胞の免疫活性化機序を解明し、EV由来の免疫増強因子をアジュバントへ応用する事を研究目的とする。研究2年目に該当する本年では、EVの効率的な回収法の開発を行った。EVの細胞内取込みを観察・測定するには大量のEVサンプルが必要でありEV回収段階が研究の律速となっていた。これまでに汎用されている超遠心分離法を用いて、3種類の細胞株で試験したところ、10 mLの細胞培養液上清から回収されたEVの平均粒子数はおよそ3.0E+8 (n = 3-4独立試験)であった。回収量が少なく、5時間程度の作業時間を要するため、回収方法の改善が必要だと考えた。そこで、EVに特異的に結合する曲率認識ペプチドを用いた新たなEV回収法を独自に開発した。曲率認識ペプチドをアガロース樹脂に固定化し、10 mLの細胞培養液上清からEVの回収を試みたところ、回収されたEVの平均粒子数はおよそ1.2E+9(n = 5独立試験)であり、超遠心分離法と比べて回収量が4倍に改善された。また、作業時間は超遠心分離法の1/3 (1.6時間)にまで短縮することができた。粒径分布は曲率認識ペプチドで回収したEVの超遠心法よりも小さいことが分かった。EVの純度を調べるためにマーカータンパク質であるCD63を標的としたウェスタンブロットを行ったところ、曲率認識ペプチドで回収したEVの方が超遠心分離法より濃いバンドが見られたことから、既存手法よりも高純度のEVが得られていることが分かった。

The biological significance of extracellular vesicles (EVs) secreted by these cells is unknown. In recent years, researches on EV immune cell activation have been carried out, and the results of EV immune cell activation have been analyzed. The mechanism of EV immune cell activation and the mechanism of EV inclusion release have been studied. The substance information of EV immune activity center has been analyzed. The aim of this study is to elucidate the cellular immune activation mechanism of EVs, and to investigate the role of EV-derived immune enhancing factors. This year, the study aims to explore the development of a new approach to EV efficiency. A large number of EV samples were collected and analyzed. The average number of particles in the supernatant of 10 mL of cell culture medium was 3.0E+8 (n = 3-4 independent tests). The amount of recovery is less than 5 minutes, and the operation time is more important. The improvement of recovery method is necessary. The new EV recovery method has been developed independently in the application of the new EV recovery method. The average particle count of EV in supernatant of 10 mL of cell culture medium immobilized on resin was 1.2E+9(n = 5 independent experiments), and the recovery amount was 4 times better than that of the ultra-telecentric separation method. The working time is shortened by 1/3 (1.6 time) of the ultra-telecentric separation method. The particle size distribution is very small due to the small size of EV's ultra-remote control method based on curvature recognition. EV purity is adjusted to CD63 standard, and EV purity is adjusted to CD63 standard. EV purity is adjusted to CD63 standard.