タンパク質障害物を利用したCRISPR-Cas3による遺伝子欠損領域の制御

E. coli CRISPR-Cas3システムは任意の配列から一方向に長鎖欠損変異を誘導する事ができる新規国産ゲノム編集ツールである。Cas3はDNAヘリカーゼ活性によりDNAを巻き取りながら移動し、DNAニッカーゼ活性によってDNAを次々と切断していくことで長い欠損変異を誘導すると考えられているが、その欠損変異の長さについては様々である。このCas3システムを精密なゲノム編集ツールとして確立させるには、欠損変異の長さを制御する方法の開発が不可欠であるが、現状ではこれを制御する方法は無い。そこで本研究はCRISPR-Cas3による遺伝子欠損領域を制御する技術開発を目標としており、２年度目はCas3がゲノム上を移動する際に遭遇するタンパク質を解析する方法の開発を行なった。結果として、上記Cas3がどのようなタンパク質とゲノム上で遭遇しているか解析する技術の開発に成功した。この方法は申請時提案したものとは違った方法だが、特定の因子だけでなく、より包括的に解析できる点において、優れた方法であると考えている。この解析の結果、潜在的にCas3の欠損変異のパターンを変化させ得るいくつかの因子について検出を行うことができ、今後の技術開発に重要となると思われる。最終年度は、初年度、２年度目に得られた知見や技術をもとに、効率よくCas3欠損変異のパターンを制御する方法について具体的に検討し、その有用性を示していく予定である。

E. coli CRISPR-Cas3システムは任意の配列から一方向に長鎖欠損変異を誘導する事ができる新規国産ゲノム編集ツールである。Cas3はDNAヘリカーゼ活性によりDNAを巻き取りながら移動し、DNAニッカーゼ活性によってDNAを次々と切断していくことで長い欠損変異を誘導すると考えられているが、その欠損変異の長さについては様々である。このCas3システムを精密なゲノム編集ツールとして確立させるには、欠損変異の長さを制御する方法の開発が不可欠であるが、現状ではこれを制御する方法は無い。そこで本研究はCRISPR-Cas3による遺伝子欠損領域を制御する技術開発を目標としており、２年度目はCas3がゲノム上を移動する際に遭遇するタンパク質を解析する方法の開発を行なった。結果として、上記Cas3がどのようなタンパク質とゲノム上で遭遇しているか解析する技術の開発に成功した。この方法は申請時提案したものとは違った方法だが、特定の因子だけでなく、より包括的に解析できる点において、優れた方法であると考えている。この解析の結果、潜在的にCas3の欠損変異のパターンを変化させ得るいくつかの因子について検出を行うことができ、今後の技術開発に重要となると思われる。最終年度は、初年度、２年度目に得られた知見や技術をもとに、効率よくCas3欠損変異のパターンを制御する方法について具体的に検討し、その有用性を示していく予定である。