タンパク質障害物を利用したCRISPR-Cas3による遺伝子欠損領域の制御

利用蛋白质障碍通过 CRISPR-Cas3 控制基因缺陷区域

基本信息

批准号：
21K15361
负责人：
小島佑介
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

E. coli CRISPR-Cas3システムは任意の配列から一方向に長鎖欠損変異を誘導する事ができる新規国産ゲノム編集ツールである。Cas3はDNAヘリカーゼ活性によりDNAを巻き取りながら移動し、DNAニッカーゼ活性によってDNAを次々と切断していくことで長い欠損変異を誘導すると考えられているが、その欠損変異の長さについては様々である。このCas3システムを精密なゲノム編集ツールとして確立させるには、欠損変異の長さを制御する方法の開発が不可欠であるが、現状ではこれを制御する方法は無い。そこで本研究はCRISPR-Cas3による遺伝子欠損領域を制御する技術開発を目標としており、２年度目はCas3がゲノム上を移動する際に遭遇するタンパク質を解析する方法の開発を行なった。結果として、上記Cas3がどのようなタンパク質とゲノム上で遭遇しているか解析する技術の開発に成功した。この方法は申請時提案したものとは違った方法だが、特定の因子だけでなく、より包括的に解析できる点において、優れた方法であると考えている。この解析の結果、潜在的にCas3の欠損変異のパターンを変化させ得るいくつかの因子について検出を行うことができ、今後の技術開発に重要となると思われる。最終年度は、初年度、２年度目に得られた知見や技術をもとに、効率よくCas3欠損変異のパターンを制御する方法について具体的に検討し、その有用性を示していく予定である。

大肠杆菌CRISPR-CAS3系统是一种新型的家庭基因组编辑工具，能够从任何序列中诱导长链有缺陷的突变。据认为，CAS3在将DNA解旋酶活性引起的DNA时移动，并通过DNA镍酶活性将DNA接一个地裂开，从而导致长度有缺陷的突变，但有缺陷的突变的长度有所不同。为了将此CAS3系统建立为精确的基因组编辑工具，必须开发一种控制有缺陷突变长度的方法，但目前无法控制这一点。因此，这项研究旨在开发技术来控制由CRISPR-CAS3引起的基因缺陷区域，在第2财年，我们开发了一种分析Cas3通过基因组迁移时遇到的蛋白质的方法。结果，我们成功地开发了一项技术来分析上面遇到什么样的蛋白质和基因组。该方法与应用时提议的方法不同，但是我们认为，这不仅是特定因素，而且在能够更全面的分析方面都是一种出色的方法。由于这项分析，可以检测几个可能改变CAS3有缺陷突变模式的因素，这对于未来的技术发展可能很重要。在最后一年，我们计划根据第一年和第二年获得的知识和技术有效地控制CAS3缺陷突变的模式，并证明其有用性。