癌細胞遊走におけるRif低分子量Gタンパク質の活性制御機構と機能の解明

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内在性のRifの細胞内分布を解析するため、培養細胞を細胞質画分と核画分に分画し、それらの溶解液に含まれるRifをwestern blot解析した。その結果、調べた３種類の細胞株全てにおいて内在性Rifが細胞質画分と核画分の両方に含まれていることを見出した。Rifが核に局在することはこれまでに報告はないため、その核局在機構についてさらに検討することとした。そこで、RifのC末端領域のCAAXモチーフと塩基性アミノ酸領域(PBR)に着目し、CAAXモチーフのCをSに置換させたSAAX変異体と、PBRの5箇所の塩基性アミノ酸をグルタミンに置換させた5Q変異体を作製し、それらをYFP融合タンパク質として293T細胞に発現させた。共焦点レーザー顕微鏡解析の結果、YFP-Rif(WT)は細胞膜と核膜および核内に局在したが、YFP-Rif(5Q)とYFP-Rif(SAAX)は細胞膜と核膜への局在が認められず、YFP-Rif(5Q)は細胞質全体に、YFP-Rif(SAAX)は核内にそれぞれ局在した。興味深いことに、YFP-Rif(WT)発現細胞では核膜のチューブ状変形が認められたが、そのような核膜変形はYFP-Rif(5Q)とYFP-Rif(SAAX)の発現細胞では認められなかった。また、核局在シグナルを付加したYFP-Rif(WT)は核膜変形をより強く誘導し、核外移行シグナルを付加したYFP-Rif(WT)は核膜変形を誘導しなかった。以上の結果から、RifはPBRとCAAXを介して核膜に局在し核膜の形態制御に関与していることが示された。本年度　は、肺腺癌細胞株PC-9においてRifをCRISPR/Cas9によってノックアウトすることに成功し、そのノックアウトPC-9細胞に上記の各種YFP-Rifを安定発現させた細胞も樹立した。