癌細胞遊走におけるRif低分子量Gタンパク質の活性制御機構と機能の解明

阐明Rif低分子量G蛋白在癌细胞迁移中的活性控制机制和功能

• 批准号: 21K15365
• 负责人: 星 京香
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15365/
• 关键词: Rif; 核膜; Rhoファミリー; SmgGDS; GDP-GTP交換因子; 癌細胞遊走; 低分子量Gタンパク質; 糸状突起

内在性のRifの細胞内分布を解析するため、培養細胞を細胞質画分と核画分に分画し、それらの溶解液に含まれるRifをwestern blot解析した。その結果、調べた３種類の細胞株全てにおいて内在性Rifが細胞質画分と核画分の両方に含まれていることを見出した。Rifが核に局在することはこれまでに報告はないため、その核局在機構についてさらに検討することとした。そこで、RifのC末端領域のCAAXモチーフと塩基性アミノ酸領域(PBR)に着目し、CAAXモチーフのCをSに置換させたSAAX変異体と、PBRの5箇所の塩基性アミノ酸をグルタミンに置換させた5Q変異体を作製し、それらをYFP融合タンパク質として293T細胞に発現させた。共焦点レーザー顕微鏡解析の結果、YFP-Rif(WT)は細胞膜と核膜および核内に局在したが、YFP-Rif(5Q)とYFP-Rif(SAAX)は細胞膜と核膜への局在が認められず、YFP-Rif(5Q)は細胞質全体に、YFP-Rif(SAAX)は核内にそれぞれ局在した。興味深いことに、YFP-Rif(WT)発現細胞では核膜のチューブ状変形が認められたが、そのような核膜変形はYFP-Rif(5Q)とYFP-Rif(SAAX)の発現細胞では認められなかった。また、核局在シグナルを付加したYFP-Rif(WT)は核膜変形をより強く誘導し、核外移行シグナルを付加したYFP-Rif(WT)は核膜変形を誘導しなかった。以上の結果から、RifはPBRとCAAXを介して核膜に局在し核膜の形態制御に関与していることが示された。本年度　は、肺腺癌細胞株PC-9においてRifをCRISPR/Cas9によってノックアウトすることに成功し、そのノックアウトPC-9細胞に上記の各種YFP-Rifを安定発現させた細胞も樹立した。

Analysis of the intracellular distribution of intrinsic Rif in cultured cells by cytoplasmic and nuclear analysis and Western blot analysis of Rif in lysates The results showed that the three kinds of cell lines were completely different from each other. The intrinsic Rif of cytoplasm and nucleus were different from each other. The Rif has a report on the agency's activities. CAAX, CAAX, CAAX. The results of confocal microscopy analysis, YFP-Rif(WT), YFP-Rif (5Q), YFP-Rif (SAAX), YFP-R YFP-Rif(WT) developing cells are characterized by nuclear membrane changes, and YFP-Rif(5Q) and YFP-Rif(SAAX) developing cells are characterized by nuclear membrane changes. YFP-Rif (WT) nuclear membrane deformation induced by strong nuclear and extra-nuclear migration The above results show that the nuclear membrane is controlled by PBR and CAAX. This year, the lung adenocarcinoma cell line PC-9 was successfully established in CRISPR/Cas9 cells.

项目成果

Rif低分子量Gタンパク質の細胞内局在と機能の制御機構

Rif低分子G蛋白亚细胞定位及功能的调控机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 渡部祐亮;星京香;紙崎孝基;澁谷浩司;南康博;西田満
• 通讯作者: 西田満