CARD9遺伝子変異の機能解析法の確立

CARD9基因突变功能分析方法的建立

基本信息

批准号：
21K15904
负责人：
香川礼子
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15904/
关键词：
CARD9 NF-kB IL1B IL6 IL8 CXCL1 CARD7 機能解析 TNF-α IL-6 IL-8 CARD7欠損症原発性免疫不全症真菌感染症

项目摘要

CARD9欠損症は、CARD9遺伝子の機能喪失型変異により発症する原発性免疫不全症である。本症は早期診断、治療がのぞまれるが、特徴的な生化学所見がないため、臨床所見と遺伝子検査が現在の診断手段である。診断には現在次世代シークエンスなどが使用されているが、遺伝子解析で検出される変化の病的意義の評価が必要となる。本研究では、CARD9変異の病的意義を正確に判断するためのin vitro評価系を開発している。本研究では、本邦初のCARD9新規変異患者を遺伝子解析において同定した。患者細胞においてCARD9のmRNA、タンパク発現は正常に認めた。患者細胞のCD14+単球を用いて、カンジダまたは黒色真菌で刺激したところ、TNF-α, IL-6, IL-8の産生が低下していた。追加実験として、無症状で同胞のCD14+細胞をおこなったところ同様にTNF-α, IL-6, IL-8の低下が示された。一方で、LPSの刺激ではTNF-α, IL-6, IL-8は正常反応を示した。つぎに、HEK293T細胞に変異型CARD9を強制発現させCARD9変異タンパクの検討、NF-kB転写活性を評価したが、野生型との有意差を認めなかった。HEK293T細胞に変異型CARD9を発現させることで誘導される下流の分子群（IL1B, IL6, IL8, CXCL1など）の評価を行なった。野生型または変異型CARD9導入することで誘導されるIL1B, IL6, IL8, CXCL1のmRNAを定量PCRで測定したところ、IL8の低下が認められた。次に、CRISPR/Cas9を用いたCARD9-null THP-1細胞の作製を行なった。この細胞に野生型または変異型CARD9を強制発現させ、真菌刺激によるするIL1B, IL6, IL8, CXCL1のmRNAを定量PCRで測定している。

Card9缺乏症是一种原发性免疫缺陷障碍，由于Card9基因的功能丧失突变而发展。尽管需要对该疾病的早期诊断和治疗，但临床发现和基因检测是当前的诊断方法，因为没有独特的生化发现。尽管目前正在使用下一代测序等，但有必要评估通过遗传分析检测到的变化的病理意义。这项研究开发了一个体外评估系统，以准确确定Card9突变的病理意义。在这项研究中，通过遗传分析确定了日本新的CARD9突变的第一位患者。在患者细胞中正常观察到Card9的mRNA和蛋白质表达。使用患者细胞的CD14+单核细胞用念珠菌或黑色真菌刺激降低TNF-α，IL-6和IL-8的产生。在另一个实验中，无疑进行的同胞CD14+细胞显示TNF-α，IL-6和IL-8的降低。另一方面，TNF-α，IL-6和IL-8在刺激LP时显示出正常的响应。接下来，我们强行表达了HEK293T细胞中的突变card9，并检查了Card9突变蛋白并评估了NF-KB的转录活性，但与野生型相关的差异没有显着差异。我们评估了通过在HEK293T细胞中表达突变card9引起的下游分子基（IL1B，IL6，IL8，CXCL1等）。通过定量PCR测量了引入野生型或突变card9引起的IL1B，IL6，IL8和CXCL1的mRNA，观察到IL8的降低。接下来，使用CRISPR/CAS9制备Card9-Null THP-1细胞。细胞被迫表达野生型或突变card9，并通过定量PCR测量了由真菌刺激的IL1B，IL6，IL8和CXCL1的mRNA。