CARD9遺伝子変異の機能解析法の確立

点击翻译按钮获取中文摘要

CARD9欠損症は、CARD9遺伝子の機能喪失型変異により発症する原発性免疫不全症である。本症は早期診断、治療がのぞまれるが、特徴的な生化学所見がないため、臨床所見と遺伝子検査が現在の診断手段である。診断には現在次世代シークエンスなどが使用されているが、遺伝子解析で検出される変化の病的意義の評価が必要となる。本研究では、CARD9変異の病的意義を正確に判断するためのin vitro評価系を開発している。本研究では、本邦初のCARD9新規変異患者を遺伝子解析において同定した。患者細胞においてCARD9のmRNA、タンパク発現は正常に認めた。患者細胞のCD14+単球を用いて、カンジダまたは黒色真菌で刺激したところ、TNF-α, IL-6, IL-8の産生が低下していた。追加実験として、無症状で同胞のCD14+細胞をおこなったところ同様にTNF-α, IL-6, IL-8の低下が示された。一方で、LPSの刺激ではTNF-α, IL-6, IL-8は正常反応を示した。つぎに、HEK293T細胞に変異型CARD9を強制発現させCARD9変異タンパクの検討、NF-kB転写活性を評価したが、野生型との有意差を認めなかった。HEK293T細胞に変異型CARD9を発現させることで誘導される下流の分子群（IL1B, IL6, IL8, CXCL1など）の評価を行なった。野生型または変異型CARD9導入することで誘導されるIL1B, IL6, IL8, CXCL1のmRNAを定量PCRで測定したところ、IL8の低下が認められた。次に、CRISPR/Cas9を用いたCARD9-null THP-1細胞の作製を行なった。この細胞に野生型または変異型CARD9を強制発現させ、真菌刺激によるするIL1B, IL6, IL8, CXCL1のmRNAを定量PCRで測定している。