新規迅速高感度遺伝子変異検出法による遺伝子変異微量含有検体の有用性の確立

使用新型快速、高灵敏度的基因突变检测方法确定含有微量基因突变的样品的有用性

• 批准号: 21K16121
• 负责人: 藤田 一喬
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16121/
• 关键词: 迅速高感度PCR法; NGS法; 血漿cfDNA; 肺癌; PNA-LNA dual PCR（PLDP）; 迅速高感度Real-time PCR法; 細胞検体

我々が開発した迅速高感度のReal-time PCR法（PNA-LNA dual PCR：PLDP法）と、NGS法を比較した。NGS法は、version-upしたため、旧法と新法と比較した（NGS-A法→NGS-C法）。2016年12月～2019年3月までの、主に気管支鏡で回収した細胞検体を用い、drive遺伝子変異と獲得耐性T790Mの両者の検出のあった17検体で比較した。EGFR遺伝子変異［Ex19del/L858R/T790M］の検出数は、細胞検体を用いた群では、PLDP法［10/7/17］、NGS-C法［10/7/9］、NGS-A法［8/5/8］に対し、組織検体を用いたコンパニオン診断では[8/6/5]であり、PLDP法の検出率は優れていた。次に、抽出したDNA自体と、PLDP法の1st amplicon（PNAにより変異のない遺伝子の増幅が抑制され、変異のある遺伝子変異のみ増幅されたPCR産物）を精製したものを、NGS-C法で解析した結果、Ex19delの領域は1/10（15.6x10^3±9.6x10^3 reads→1.4x10^3±0.88x10^3 reads）に、L858Rの領域は1/1000（2.2x10^3±16.2x10^3 reads→ 3.1±2.3 reads）に、T790Mの領域は1/10000（21.82x10^3±14.3x10^3 reads → 2.0±1.3 reads）に、変異のない遺伝子の増幅は抑制されていた。変異のある遺伝子はほぼ同数の断片数であり、PNAによる変異のない遺伝子の増幅抑制が確認された。また、上記期間内で提出された血液検体の血漿より抽出されたcell-free DNA（cfDNA）と、同時に採取された細胞検体からのDNAを、PLDP法で検出した結果、肺癌の進行が進むにつれて検出率が上昇することが確認された。

我们比较了使用NGS方法开发的快速，高度敏感的实时PCR方法（PNA-LNA双PCR：PLDP方法）。 NGS方法已更新，因此已与旧方法（NGS-A方法→NGS-C方法）进行了比较。将主要从2016年12月至2019年3月收集的细胞标本与通过驱动基因突变和获得的耐药性T790M检测到的17个标本进行了比较。使用细胞样品[8/6/5]在组中检测到的EGFR基因突变[EX19DEL/L858R/T790M]与PLDP方法[8/6/5]进行伴有诊断[8/6/5]，与PLDP方法[8/6/5]相比，与PLDP方法[10/7/17/17]，NGS-C-C方法[10/7/17]，NGS-C-C方法[10/7/9]和NGS-CADECT [10/7/9]和NGS-STS-ANT MEDATION和NGS MEDATION和8/5/8/5/8/8/8/8/8/8/2 PLDP方法非常好。接下来，使用NGS-C方法对PLDP方法的提取的DNA本身和PLDP方法的第一个扩增子（PCR产物抑制了无突变基因，仅抑制突变突变）。 The region of Ex19del was 1/10 (15.6x10^3±9.6x10^3 reads→1.4x10^3±0.88x10^3 reads), the region of L858R was 1/1000 (2.2x10^3±16.2x10^3 reads→3.1±2.3 reads), and the region of T790M was 1/10000 （21.82x10^3±14.3x10^3读数→2.0±1.3读）抑制了突变基因的扩增。突变的基因具有几乎相同的片段，PNA证实了抑制没有突变的基因的扩增。此外，使用PLDP方法从上述周期内提取的血液样本的血浆中提取的无细胞DNA（CFDNA），并从同时收集的细胞样品中提取DNA，并证实，随着肺癌的进展，检测率会增加。