Machanistic analysis of Ca2+ elevation before the terminal differentiation (cell death) of cutaneous epithelial cells

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陸上脊椎動物は皮膚によって外界から保護されており、そのバリア機能のために最も重要な構造は角層と呼ばれる死細胞のシートである。角層は、皮膚上皮細胞が角化と呼ばれるプログラム細胞死を起こして形成されるが、その誘導メカニズムはほとんど分かっておらず、角化の異常をきたす疾患の特異的な治療法はない。本研究では、皮膚上皮細胞が角化の直前に細胞質カルシウムイオン濃度を上昇させるという現象を手がかりとする。定常状態で角化直前に上昇する細胞質カルシウムイオンの由来を同定し、角化におけるカルシウムイオンの役割を明らかにするとともに、その移動を担う分子を突き止めることを目標とする。本研究では、阻害薬スクリーニングとCRISPRスクリーニングを用いて、上記の課題に取り組む。阻害薬スクリーニングでは、培養角化細胞に発現する分子のスクリーニングの結果に基づいて、発現の高い分子に関する阻害薬を順に用いていく。CRISPRスクリーニングでは、カルシウムイオン濃度を可視化するGCaMP3を指標として、順遺伝学的スクリーニングを実施する。2022年度は、研究代表者の異動と、新型コロナウイルスへの自身の感染や対応のため、あまり研究を進めることができなかったが、以下の内容を行った。遺伝子組み換え実験の学内申請と承認。CRISPRスクリーニングのためのgRNAデザインの方法を立ち上げた。CRISPRスクリーニングで用いる培養細胞に必要な遺伝子を、Lentivirus vectorを用いて導入した。また、スクリーニングのアウトプットの部分で必要な次世代シーケンサーを用いた、カスタム解析を実行できるよう、技術を習得した。