Development of a single-cell analysis method of Akt signaling using a high-sensitive luminescent probe

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本研究ではAktの活性動態を一細胞毎に追跡する発光プローブを開発することで時空間的なAkt活性動態の測定を実現することを目標としている。本年度においてはAkt発光プローブの概念実証を行い、Aktのリン酸化により局在が変化するタンパク質ドメインとルシフェラーゼ断片を融合することで、タンパク質ドメインの局在変化に応じて発光量が変化することを確認した。また、よりAkt活性特異的な活性変化を達成するためタンパク質ドメインに対して変異導入、及び不要な配列の除去を施した。これらの改良によりAkt阻害剤刺激後最大で3倍程度の発光量変化が観察された。観察結果からは未刺激時の発光量が想定よりも高いことが推測されたため、今後は未刺激時での発光量を低くする改良を施す予定である。また、光活性化型Aktを用いたオミクス解析によりAkt単体の活性化により制御される代謝経路の特定に成功した。この知見はAkt発光プローブの応用先として想定している解糖系の数理モデル化に活かすことができると期待される。具体的には、Aktは糖取り込みから開始される解糖系の、特に下流解糖系に作用が大きいことが示唆された。そこで、Aktの活性動態は解糖系下流と強く関係していることが考えられるため、解糖系下流を中心とした反応のモデル化を行うことにした。加えて、得られた解析結果はAkt単体の活性化により解糖系が駆動されることを示しており、本研究で考案した光操作によりAkt活性動態に対して時空間的な摂動を加えることで、解糖系を対象とした細胞機能の解析が実現可能であることを示唆している。