発光タンパク質ルシフェラーゼを利用した細胞間シグナル伝達の定量的解析法の開発

本研究では、光制御法に対する発光タンパク質ルシフェラーゼを用いた制御および評価法の開発を行った。まず発光による光制御法の開発として、光制御プローブの主駆動波長域である青色で発光するルシフェラーゼNanoLuc（NLuc)をもちい、ルシフェラーゼの発光による光制御プローブ駆動の可能性を検証した。光制御プローブとしては既存のβカテニンシグナル伝達系を制御する系を利用した。検証の結果、NLuc発光により光制御系を駆動することは可能であり、効率の良い制御には可能な限り制御因子であるNLucと被制御因子である光制御プローブの距離を短くすることが重要であることが判明した。また、近接具合が十分であればNLucと光制御プローブを分離した条件においても光制御プローブの駆動が可能であった。次にルシフェラーゼをもちいた光制御系の評価法の開発として、βカテニンシグナル伝達系を対象とした一細胞レベルで光制御によるシグナル伝達の活性化が追跡可能な発光レポーターを開発した。顕微鏡下で観察し得られた画像を処理するプログラムを構築し、NLucの発光量変化とレポーターからのシグナル変化をそれぞれ一細胞レベルで定量可能な評価系を実現した。これらの系をもちい、発光によるβカテニンシグナル伝達制御の一細胞レベルでの解析を行ったところ、発光により最大で1.3倍程度の活性化が得られた。また発光の強度とレポーターのシグナル強度との間には明確な相関は見られなかったことから、発光の強度と光制御系の制御能の関係性は単純な比例関係にないことが推測された。以上の結果から、本研究課題で取り組んだ発光駆動の光制御系は実現可能であることが分かった。また光制御能を定性的に一細胞レベルで評価可能な系を開発した。これらの制御系と評価系により細胞集団において一細胞レベルでのシグナル伝達の定量評価、および制御が可能になることが期待される。

本研究では、光制御法に対する発光タンパク質ルシフェラーゼを用いた制御および評価法の開発を行った。まず発光による光制御法の開発として、光制御プローブの主駆動波長域である青色で発光するルシフェラーゼNanoLuc（NLuc)をもちい、ルシフェラーゼの発光による光制御プローブ駆動の可能性を検証した。光制御プローブとしては既存のβカテニンシグナル伝達系を制御する系を利用した。検証の結果、NLuc発光により光制御系を駆動することは可能であり、効率の良い制御には可能な限り制御因子であるNLucと被制御因子である光制御プローブの距離を短くすることが重要であることが判明した。また、近接具合が十分であればNLucと光制御プローブを分離した条件においても光制御プローブの駆動が可能であった。次にルシフェラーゼをもちいた光制御系の評価法の開発として、βカテニンシグナル伝達系を対象とした一細胞レベルで光制御によるシグナル伝達の活性化が追跡可能な発光レポーターを開発した。顕微鏡下で観察し得られた画像を処理するプログラムを構築し、NLucの発光量変化とレポーターからのシグナル変化をそれぞれ一細胞レベルで定量可能な評価系を実現した。これらの系をもちい、発光によるβカテニンシグナル伝達制御の一細胞レベルでの解析を行ったところ、発光により最大で1.3倍程度の活性化が得られた。また発光の強度とレポーターのシグナル強度との間には明確な相関は見られなかったことから、発光の強度と光制御系の制御能の関係性は単純な比例関係にないことが推測された。以上の結果から、本研究課題で取り組んだ発光駆動の光制御系は実現可能であることが分かった。また光制御能を定性的に一細胞レベルで評価可能な系を開発した。これらの制御系と評価系により細胞集団において一細胞レベルでのシグナル伝達の定量評価、および制御が可能になることが期待される。