sRNAが支配する大腸菌の胃酸耐性制御メカニズムの解明とその感染防除法への応用

2022年度の研究成果は、主に以下の2点である。①GcvB sRNAが大腸菌の芳香族アミノ酸代謝を制御する分子メカニズムの解明まず、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、Trp）の生合成酵素およびトランスポーターをコードする全ての遺伝子（制御が既知のものを除いて20遺伝子）に対してin silico解析を実施し、GcvBとの塩基対形成領域を予想した。次に、この予想領域周辺をgfp遺伝子に融合しレポーターアッセイを行ったところ、GcvBの高発現により14遺伝子の翻訳レベルが変化した。さらにこれらから生理的なターゲットを絞り込むため、GcvBをアラビノース誘導性プロモーターから短時間（10分間）発現させ、各遺伝子のRNAレベルの変化をRT-qPCRにより定量した。その結果、生合成酵素であるAroG、PheA、TrpC、さらにトランスポーターであるPhePをコードするmRNAは、GcvB発現により有意に減少した。以上の結果より、これら4遺伝子はGcvBが塩基対形成することで翻訳が抑制され、かつRNAが不安定化される新規ターゲットであると考えられる。②GcvB sRNAによる芳香族アミノ酸代謝の制御がもたらす増殖への影響の解析最小培地を用いて培養実験を行ったところ、ベクターコントロールでは芳香族アミノ酸添加に伴い増殖が増大したが、GcvB高発現株ではそのような増大は見られなかった。また、タンパク質構成アミノ酸20種から芳香族アミノ酸を除いた17種のみを添加した最小培地では、ベクターコントロールと比較して、GcvB高発現株の増殖に遅延が見られた。これらの現象は、GcvBが芳香族アミノ酸のトランスポーターおよび生合成酵素の翻訳を抑制することで生じたと考えることができ、①で解明した分子生物学的知見に一致した。

2022年度の研究成果は、主に以下の2点である。①GcvB sRNAが大腸菌の芳香族アミノ酸代謝を制御する分子メカニズムの解明まず、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、Trp）の生合成酵素およびトランスポーターをコードする全ての遺伝子（制御が既知のものを除いて20遺伝子）に対してin silico解析を実施し、GcvBとの塩基対形成領域を予想した。次に、この予想領域周辺をgfp遺伝子に融合しレポーターアッセイを行ったところ、GcvBの高発現により14遺伝子の翻訳レベルが変化した。さらにこれらから生理的なターゲットを絞り込むため、GcvBをアラビノース誘導性プロモーターから短時間（10分間）発現させ、各遺伝子のRNAレベルの変化をRT-qPCRにより定量した。その結果、生合成酵素であるAroG、PheA、TrpC、さらにトランスポーターであるPhePをコードするmRNAは、GcvB発現により有意に減少した。以上の結果より、これら4遺伝子はGcvBが塩基対形成することで翻訳が抑制され、かつRNAが不安定化される新規ターゲットであると考えられる。②GcvB sRNAによる芳香族アミノ酸代謝の制御がもたらす増殖への影響の解析最小培地を用いて培養実験を行ったところ、ベクターコントロールでは芳香族アミノ酸添加に伴い増殖が増大したが、GcvB高発現株ではそのような増大は見られなかった。また、タンパク質構成アミノ酸20種から芳香族アミノ酸を除いた17種のみを添加した最小培地では、ベクターコントロールと比較して、GcvB高発現株の増殖に遅延が見られた。これらの現象は、GcvBが芳香族アミノ酸のトランスポーターおよび生合成酵素の翻訳を抑制することで生じたと考えることができ、①で解明した分子生物学的知見に一致した。