Direct electron transfer reaction established by fungal redox proteins

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酵素による触媒反応と電極での電気化学反応を共役させた反応を酵素電極反応といい、電気化学的なバイオセンサーや物質変換、バイオ燃料電池の基盤となる。酵素と電極間で直接的な電子の授受が起こる直接電子移動反応(DET)は非常にシンプルな反応系となるのが利点である。しかし、酵素の立体構造に大きく依存することから、DETが可能な酸化還元酵素の種類は全体のごく一部に限られているのが課題となっている。そこで研究代表者は、優れたDET反応を示す糸状菌由来のピロロキノリンキノン(PQQ)、フラビン(FAD)、ヘムなどを活性中心に有する酸化還元酵素に注目し、これらの酸化還元タンパク質の性質を明らかとし、それを利用した直接電子移動反応系の設計手法と酵素電極の開発を目的としている。本年度は、糸状菌のPQQ依存性ピラノース脱水素酵素とFAD依存性セロビオース脱水素酵素を対象に、DET反応系の構築とそれを基にした酵素の解析、変異導入が与える電子移動反応への影響を調べた。まずは、ピラノース脱水素酵素の触媒ドメインのみを用いて、酵素活性中心のPQQの酸化還元反応について解析した。DET法により酸化還元電位を測定し、電位のpH依存性の詳細について明らかにした。その結果、酵素内PQQのセキミノンの生成定数が明らかとなり、水溶液中のフリーのPQQに比べてセキミノンが安定化されていることがわかった。さらにPQQのキノン部位のpKaを決定し、プロトン共役電子移動に関する知見を得た。セロビオース脱水素酵素について、電極への固定化方法を検討し、DET型酵素電極反応を確立した。さらにシトクロムドメインの変異体を作製し、ヘムプロピオン酸近傍への変異導入によりヘムの酸化還元電位をコントロールできることがわかった。