セラミド非小胞輸送に関与する新規タンパク質の同定と機能解明

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細胞内セラミドの量はオルガネラ間輸送によってコントロールされている。小胞体からゴルジ体へのセラミド輸送には、小胞輸送に加えて非小胞輸送が存在する。これまでの解析から私たちは、真核細胞で保存された小胞体膜タンパク質であるTricalbin (Tcb1, 2, 3) が、セラミドの非小胞輸送に必要であることを発見した。しかしながら、Tricalbinの機能がどのように制御されているか、他にはどのようなタンパク質が関与しているのかなど、セラミド非小胞輸送機構の全貌は未だ謎に包まれている。そこで本研究は、セラミド非小胞輸送に関与する候補タンパクのリストアップと機能同定を目指す。この目的を達成するために本年度は、Tcb3タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を試みた。研究実績の概要は、以下の3点である。(1)Tcb3ドメインと相互作用する細胞質タンパク質の同定：GFPタグを融合したTcb3の細胞質ドメインを用いて、抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によって結合タンパク質を精製し、質量分析によって同定を行った。 (2) Tcb3と相互作用する膜タンパク質の同定：当初は技術的に困難であると予想されたことから、細胞質タンパク質のみを対象として解析する予定であった。しかし、実験手法を洗練したことにより、膜タンパク質の精製および同定に成功した。(3)同定されたタンパク質とTcb3の結合について、免疫沈降法およびウエスタンブロッティングによって検証を行い、候補となるタンパク質をリストアップした。