核移行型ドナーDNAプラスミドによる新規遺伝子ターゲティング技術の開発

使用核转位供体 DNA 质粒开发新的基因靶向技术

• 批准号: 22K15029
• 负责人: 石橋 理基
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15029/
• 关键词: CRISPR-Cas9; CRISPR-Cas12a; Gene targeting; pCriMGET_9-12a; ゲノム編集; CRISPR-Cas; 遺伝子ターゲッティング; 核移行型ドナープラスミド; 遺伝子治療

本研究の目的は、長鎖ドナーDNAテンプレートの核移行を介した新規CRISPR-Cas遺伝子ターゲッティング技術の開発である。本年度は、以前の研究にて開発したpCriMGET（plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムを改良し、CRISPR-Cas12aを用いた遺伝子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを開発した。マウス受精卵の核にpCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク質、標的ゲノム切断用crRNAおよびpCriMGET_9-12a切断用crRNAをマイクロインジェクション法により導入し、Rosa26遺伝子領域に全長5.5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12aを用いて挿入したノックインマウスの樹立に成功した。また、Hipp11領域に全長5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas9を用いて挿入したノックインマウスの樹立にも成功し、pCriMGETシステムと比較してノックイン効率が向上した（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。加えて、複数の遺伝子座において様々な長さの長鎖ドナーDNAテンプレートを用いた遺伝子ターゲッティング個体の作出に成功した。pCriMGET_9-12aシステムの開発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISPR-Cas12aを用いても効率的な長鎖ドナーDNAテンプレートのターゲッティングが可能となった。

The purpose of this study is to develop new CRISPR-Cas gene transfer technology for DNA gene transfer. This year, pCriMGET (plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting) system was developed. CRISPR-Cas 12a system was developed. CRISPR-Cas 12a was successfully introduced into the nucleus of the fertilized egg pCriMGET_9 - 12a by the CRISPR-Cas 12a method, and the 5.5kb long-locked DNA gene was successfully established in the Rosa26 gene field. In addition, the use of CRISPR-Cas9 to integrate the 5-kb long lock DNA template in the Hipp11 field has been successful, and the efficiency of the pCriMGET system has increased compared with the use of the template (Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。Add to cart, add to cart, add to cart pCriMGET_9-12a is the most efficient way to develop CRISPR-Cas9.

项目成果

CRISPR-Cas9およびCRISPR-Cas12aによるin vivo切断型高汎用性遺伝子ターゲッティングplasmidの開発

使用 CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 开发体内可切割的高度通用的基因靶向质粒

• 发表时间: 2022
• 作者: Ishibashi Riki;Maki Ritsuko;Kitano Satsuki;Miyachi Hitoshi;Toyoshima Fumiko;石橋 理基
• 通讯作者: 石橋 理基