核移行型ドナーDNAプラスミドによる新規遺伝子ターゲティング技術の開発

使用核转位供体 DNA 质粒开发新的基因靶向技术

• 批准号: 22K15029
• 负责人: 石橋 理基
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15029/
• 关键词: CRISPR-Cas9; CRISPR-Cas12a; Gene targeting; pCriMGET_9-12a; ゲノム編集; CRISPR-Cas; 遺伝子ターゲッティング; 核移行型ドナープラスミド; 遺伝子治療

本研究の目的は、長鎖ドナーDNAテンプレートの核移行を介した新規CRISPR-Cas遺伝子ターゲッティング技術の開発である。本年度は、以前の研究にて開発したpCriMGET（plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムを改良し、CRISPR-Cas12aを用いた遺伝子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを開発した。マウス受精卵の核にpCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク質、標的ゲノム切断用crRNAおよびpCriMGET_9-12a切断用crRNAをマイクロインジェクション法により導入し、Rosa26遺伝子領域に全長5.5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12aを用いて挿入したノックインマウスの樹立に成功した。また、Hipp11領域に全長5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas9を用いて挿入したノックインマウスの樹立にも成功し、pCriMGETシステムと比較してノックイン効率が向上した（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。加えて、複数の遺伝子座において様々な長さの長鎖ドナーDNAテンプレートを用いた遺伝子ターゲッティング個体の作出に成功した。pCriMGET_9-12aシステムの開発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISPR-Cas12aを用いても効率的な長鎖ドナーDNAテンプレートのターゲッティングが可能となった。

Purpose の this study は, long locks ド ナ ー DNA テ ン プ レ ー ト の nuclear migration を interface し た new rules CRISPR - Cas heritage 伝 son タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ technology の open 発 で あ る. This year にて and previous <s:1> research にて developed たpCriMGET (plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene Improved targeting) シ ス テ ム を し, the CRISPR - Cas12a を with い た heritage 伝 son タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ に も 応 seaborne し た pCriMGET_9-12 - a シ ス テ ム を open 発 し た. マ ウ ス fertilized egg の nuclear に pCriMGET_9-12 - a ド ナ ー プ ラ ス ミ ド, Cas12a タ ン パ ク qualitative, mark ゲ ノ ム cut with crRNA お よ び pCriMGET_9-12 - a cut with crRNA を マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン method に よ り import し, Rosa26 subareas 伝 に total length of 5.5 KB の long locks ド ナ ー DNA テ ン プ レ ー ト を CRISPR - Cas12a を with い て scions into し た ノ ッ ク イ ン マ ウ ス の set に successful し た. ま た, long length に Hipp11 field 5 KB の lock ド ナ ー DNA テ ン プ レ ー ト を CRISPR - Cas9 を with い て scions into し た ノ ッ ク イ ン マ ウ ス の set に も successful し, pCriMGET シ ス テ ム と compare し て ノ ッ ク イ ン sharper rate が し upward た (Ishibashi R., (et al. Sci. Rep. 2022) Add え て, plural の heritage 伝 stroma に お い て others 々 な long さ の long locks ド ナ ー DNA テ ン プ レ ー ト を with い た heritage 伝 son タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ individual の make に successful し た. PCriMGET_9-12 - a シ ス テ ム の open 発 に よ り, the CRISPR - Cas9 だ け で は な く CRISPR - Cas12a を with い て も sharper rate な long locks ド ナ ー DNA テ ン プ レ ー ト の タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ が may と な っ た.

项目成果

CRISPR-Cas9およびCRISPR-Cas12aによるin vivo切断型高汎用性遺伝子ターゲッティングplasmidの開発

使用 CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 开发体内可切割的高度通用的基因靶向质粒

• 发表时间: 2022
• 作者: Ishibashi Riki;Maki Ritsuko;Kitano Satsuki;Miyachi Hitoshi;Toyoshima Fumiko;石橋 理基
• 通讯作者: 石橋 理基