核移行型ドナーDNAプラスミドによる新規遺伝子ターゲティング技術の開発

本研究の目的は、長鎖ドナーDNAテンプレートの核移行を介した新規CRISPR-Cas遺伝子ターゲッティング技術の開発である。本年度は、以前の研究にて開発したpCriMGET（plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムを改良し、CRISPR-Cas12aを用いた遺伝子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを開発した。マウス受精卵の核にpCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク質、標的ゲノム切断用crRNAおよびpCriMGET_9-12a切断用crRNAをマイクロインジェクション法により導入し、Rosa26遺伝子領域に全長5.5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12aを用いて挿入したノックインマウスの樹立に成功した。また、Hipp11領域に全長5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas9を用いて挿入したノックインマウスの樹立にも成功し、pCriMGETシステムと比較してノックイン効率が向上した（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。加えて、複数の遺伝子座において様々な長さの長鎖ドナーDNAテンプレートを用いた遺伝子ターゲッティング個体の作出に成功した。pCriMGET_9-12aシステムの開発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISPR-Cas12aを用いても効率的な長鎖ドナーDNAテンプレートのターゲッティングが可能となった。

本研究の目的は、長鎖ドナーDNAテンプレートの核移行を介した新規CRISPR-Cas遺伝子ターゲッティング技術の開発である。本年度は、以前の研究にて開発したpCriMGET（plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムを改良し、CRISPR-Cas12aを用いた遺伝子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを開発した。マウス受精卵の核にpCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク質、標的ゲノム切断用crRNAおよびpCriMGET_9-12a切断用crRNAをマイクロインジェクション法により導入し、Rosa26遺伝子領域に全長5.5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12aを用いて挿入したノックインマウスの樹立に成功した。また、Hipp11領域に全長5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas9を用いて挿入したノックインマウスの樹立にも成功し、pCriMGETシステムと比較してノックイン効率が向上した（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。加えて、複数の遺伝子座において様々な長さの長鎖ドナーDNAテンプレートを用いた遺伝子ターゲッティング個体の作出に成功した。pCriMGET_9-12aシステムの開発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISPR-Cas12aを用いても効率的な長鎖ドナーDNAテンプレートのターゲッティングが可能となった。