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核移行型ドナーDNAプラスミドによる新規遺伝子ターゲティング技術の開発

使用核转位供体 DNA 质粒开发新的基因靶向技术

基本信息

批准号：
22K15029
负责人：
石橋理基
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、長鎖ドナーDNAテンプレートの核移行を介した新規CRISPR-Cas遺伝子ターゲッティング技術の開発である。本年度は、以前の研究にて開発したpCriMGET（plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムを改良し、CRISPR-Cas12aを用いた遺伝子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを開発した。マウス受精卵の核にpCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク質、標的ゲノム切断用crRNAおよびpCriMGET_9-12a切断用crRNAをマイクロインジェクション法により導入し、Rosa26遺伝子領域に全長5.5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12aを用いて挿入したノックインマウスの樹立に成功した。また、Hipp11領域に全長5kbの長鎖ドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas9を用いて挿入したノックインマウスの樹立にも成功し、pCriMGETシステムと比較してノックイン効率が向上した（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022）。加えて、複数の遺伝子座において様々な長さの長鎖ドナーDNAテンプレートを用いた遺伝子ターゲッティング個体の作出に成功した。pCriMGET_9-12aシステムの開発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISPR-Cas12aを用いても効率的な長鎖ドナーDNAテンプレートのターゲッティングが可能となった。

The purpose of this study is to develop new CRISPR-Cas DNA technology using long-locked DNA technology. This year's and previous research has led to the development of pCriMGET (plasmid of synthetic CRISPR coded RNA target sequence-equipped donor plasmid mediated gene targeting）システムをimproved, CRISPR-Cas12a used and left子ターゲッティングにも対応したpCriMGET_9-12aシステムを开発した. The core of the fertilized egg is pCriMGET_9-12aドナープラスミド、Cas12aタンパク性、 Target crRNA for cleavage およびpCriMGET_9-12a crRNA for cleavage をマイクロインジェクション法により Importし、Rosa26 legacy subdomainにFull length 5.5kbのLong lockドナーDNAテンプレートをCRISPR-Cas12a was successfully established using いて insertion and したノックインマウスの.また、Hipp11 domain にFull length 5kb long lock ドナーDNA テンプレートをCRISPR-Cas9をinsert いてしたノックインマウスのEstablishment of successし、pCriMGETシステムとComparison of efficiencyがUPした（Ishibashi R., et al. Sci. Rep. 2022). Add えて、plural の缝子肖において様々な长さの长 lock ドナーDNAテンプレートを Use the いた弝子ターゲッティング individual のに Success した. pCriMGET_9-12aシステムの开発により、CRISPR-Cas9だけではなくCRISP R-Cas12a is made possible by using long-lasting DNA locks with high efficiency.