医療応用可能なCRISPR-Cas12aによる欠失導入法の確立

建立具有医学应用价值的使用CRISPR-Cas12a的缺失导入方法

• 批准号: 22K15386
• 负责人: 高橋 剛
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15386/
• 关键词: CRISPR-Cas12s; 欠失導入; CRISPR-Cas12a; ゲノム編集; 欠失変異; iPS細胞; 筋ジストロフィー

本研究は、CRISPR-Cas12a（以下、Cas12a）による高い再現性と誘導効率をもつ欠失変異導入法の確立を目指す。研究代表者は、Cas12aが標的DNA配列の切断時に5’突出末端を形成させる点に着目し、突出配列が相補的となる2つの標的を選択することで、末端が結合される正確な欠失導入が可能であることを見出した。さらに、突出末端の配列から、結合後の配列が予測できることを示唆する結果を得た。そこで本研究では、突出配列の組み合わせを網羅的に解析することで、再現性が最も高い欠失導入条件を同定する。また、Cas12aのガイドRNA多重発現能力を利用して、欠失させるDNAを断片化することで、欠失導入率を向上させる。最終的に、筋ジストロフィー患者由来iPS細胞において、本技術の遺伝子治療への応用を試みる。2022年度は、ガイドRNAの多重発現による欠失DNAの断片化が、欠失導入効率を向上させるか検討を進めた。さらに、Cas12aに加えて、よりヒト細胞での編集活性が強く、オフターゲット効果が抑制されたenCas12およびenCas12-HF1の二種類の改変体も利用した。DNA断片化を介した欠失導入のために、通常の2つの標的に加えて、欠失させるDNAフラグメント内にさらに2ヶ所・4ヶ所の標的を設定した。その結果、断片化のためのガイドRNAが発現し、狙い通りに欠失させるDNAフラグメントを切断したことを確認した。しかし、このDNA断片化は、欠失導入効率の向上には寄与しなかった。また、enCas12aとenCas12a-HF1を利用したことで、通常の2標的切断による欠失導入効率の向上が認められたが、これらの改変体においても、ガイドRNAの多重発現によるDNA断片化で欠失導入率は改善しなかった。

This study is aimed at establishing high reproducibility and induction efficiency of CRISPR-Cas12a (hereinafter referred to as Cas12a) and establishing a method for introducing the different genes. The representative of the research team, Cas12a, has a 5' protruding end that is formed when cutting the DNA sequence of the target. The complementary となる2つのを选択することで, the terminal がcombination される the correct な owed loss import がpossible であることを见出した.さらに, protruding terminal arrangement から, combination arrangement がprediction できることをshows the result するをget た. This research is based on the analysis of the combination of the outstanding arrangement and the network, and the reproducibility is the highest and the introduction conditions are the same.また, Cas12a has the ability to express RNA multiplexes by utilizing it, the DNA has been fragmented, and the introduction rate has been improved. In the end, the patient was treated with iPS cells using iPS cells, and this technology was used to treat patients. In 2022, the multi-fold development of RNA and the lack of fragmentation of DNA and the improvement of the efficiency of introduction have been improved.さらに, Cas12a にplus えて, よりヒトcell editing activity がstrongく, オフターゲット effect Inhibition of enCas12 and use of enCas12-HF1 are two types of modifications. DNA fragmentation を Introduction し た owed loss introduction の た め に , normal 2 つ の standard に plus え て , owed The set of the standard ささせるDNAフラグメント内にさらに2ヶsho・4ヶsho.そのRESULTS, Fragmented のためのガイドRNAが発appearし, Sniper い通りに无码させるDNA フラグメントを Cut off したことをconfirmed した. The problem of DNA fragmentation and the lack of efficiency of introduction are sent to the company.また、enCas12a and enCas12a-HF1をUtilize したことで、Normal 2 target cutting によるLoss of introduction efficiency のUPがRecognition of められたが, これらの reformed body においても, ガイドRNA のmultiple 発appears, DNA fragmentation and loss of the introduction rate are improved しなかった.