医療応用可能なCRISPR-Cas12aによる欠失導入法の確立

建立具有医学应用价值的使用CRISPR-Cas12a的缺失导入方法

• 批准号: 22K15386
• 负责人: 高橋 剛
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15386/
• 关键词: CRISPR-Cas12s; 欠失導入; CRISPR-Cas12a; ゲノム編集; 欠失変異; iPS細胞; 筋ジストロフィー

本研究は、CRISPR-Cas12a（以下、Cas12a）による高い再現性と誘導効率をもつ欠失変異導入法の確立を目指す。研究代表者は、Cas12aが標的DNA配列の切断時に5’突出末端を形成させる点に着目し、突出配列が相補的となる2つの標的を選択することで、末端が結合される正確な欠失導入が可能であることを見出した。さらに、突出末端の配列から、結合後の配列が予測できることを示唆する結果を得た。そこで本研究では、突出配列の組み合わせを網羅的に解析することで、再現性が最も高い欠失導入条件を同定する。また、Cas12aのガイドRNA多重発現能力を利用して、欠失させるDNAを断片化することで、欠失導入率を向上させる。最終的に、筋ジストロフィー患者由来iPS細胞において、本技術の遺伝子治療への応用を試みる。2022年度は、ガイドRNAの多重発現による欠失DNAの断片化が、欠失導入効率を向上させるか検討を進めた。さらに、Cas12aに加えて、よりヒト細胞での編集活性が強く、オフターゲット効果が抑制されたenCas12およびenCas12-HF1の二種類の改変体も利用した。DNA断片化を介した欠失導入のために、通常の2つの標的に加えて、欠失させるDNAフラグメント内にさらに2ヶ所・4ヶ所の標的を設定した。その結果、断片化のためのガイドRNAが発現し、狙い通りに欠失させるDNAフラグメントを切断したことを確認した。しかし、このDNA断片化は、欠失導入効率の向上には寄与しなかった。また、enCas12aとenCas12a-HF1を利用したことで、通常の2標的切断による欠失導入効率の向上が認められたが、これらの改変体においても、ガイドRNAの多重発現によるDNA断片化で欠失導入率は改善しなかった。

This study is aimed at establishing CRISPR-Cas 12a (hereinafter, Cas 12a) as a method for high reproducibility and induction efficiency. Research representatives focused on the formation of 5 'protruding ends during cleavage of the DNA alignment of the Cas12a target, and selected two targets with complementary protruding alignments, which made it possible to combine the ends and introduce them correctly and incorrectly. In addition, the alignment of the protruding end and the alignment after combination are predicted. In this study, the combination of prominent arrays was analyzed, and the reproducibility was determined. Cas 12a's ability to multiplex RNA was exploited, DNA fragmentation was delayed, and the rate of delayed introduction was increased. The ultimate goal of this technology is to test the application of gene therapy in patients with iPS cell origin. In 2022, we will continue to improve the efficiency of DNA fragmentation and DNA deletion in the multiple occurrence of RNA. In addition, Cas12-a and Cas12-HF1 were used to inhibit the synthesis activity of two kinds of modified substances, enCas12 and enCas 12-HF1. DNA fragmentation is usually carried out by adding 2 or more targets to DNA fragmentation, and by setting 2 or more targets within DNA fragmentation. As a result, fragmentation and DNA fragmentation have been identified. DNA fragmentation and loss of efficiency In addition, in the case of enCas12a and enCas12a-HF1, the rate of DNA fragmentation was improved due to the increase in the rate of DNA fragmentation due to the increase in the rate of DNA fragmentation due to the increase in the rate of DNA fragmentation due to the increase in the rate of DNA fragmentation.