時間分解構造解析によるアミロイド脱凝集メカニズムの研究

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本研究では、アミロイドの脱凝集過程におけるタンパク質の動きを分子レベルで可視化し、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。その為、本研究の基盤となる①酵母由来Sup35アミロイドの構造決定、②時間分解赤外分光測定および時間分解クライオ電子顕微鏡単粒子解析に最適な脱凝集反応条件の決定、③時間分解赤外分光測定のための高速混合マイクロフローセルの開発に注力した。Sup35は2種類のアミロイド（Sc4、Sc37）を形成する。クライオ電子顕微鏡実験では均一な試料を調製する事が必須である。サンプルの調製方法を改良することで均一な試料を調製できていることを質量分析で確認できたので、クライオ電子顕微鏡で観測したところ、両アミロイドの構造を高分解能で決定した。この2種類のアミロイドの構造は大きく異なっており、全反射照明顕微鏡で明らかとなっていた脱凝集反応の違いを説明しうる重要な知見を得る事ができた。また、時間分解赤外分光測定およびクライオ電子顕微鏡による時間分解構造解析に向けた脱凝集反応条件の最適化のために、チオフラビンTによる脱凝集アッセイを行なった。これにより本研究で最適な反応条件を決定する事ができた。しかし、この条件でSup35アミロイド/Ssa1/Sis1複合体を調製し、クライオ電子顕微鏡で観測したが、余剰のシャペロンがクライオ電子顕微鏡画像のコントラストを低下させてしまい、構造決定には至らなかった。時間分解赤外分光測定については、アミロイドの脱凝集反応を実時間で追跡するために、高速混合マイクロフローセルを開発した。このセルを利用して時間分解赤外分光測定により脱凝集反応を観測したところ、シャペロンの構造変化に由来するタンパク質の構造変化を捉える事ができたが、アミロイドの構造変化を捉えることはできなかった。