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時間分解構造解析によるアミロイド脱凝集メカニズムの研究

通过时间分辨结构分析研究淀粉样蛋白解聚机制

基本信息

批准号：
22K15067
负责人：
野村高志
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15067/
关键词：
アミロイド赤外分光法クライオ電子顕微鏡構造解析

项目摘要

本研究では、アミロイドの脱凝集過程におけるタンパク質の動きを分子レベルで可視化し、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。その為、本研究の基盤となる①酵母由来Sup35アミロイドの構造決定、②時間分解赤外分光測定および時間分解クライオ電子顕微鏡単粒子解析に最適な脱凝集反応条件の決定、③時間分解赤外分光測定のための高速混合マイクロフローセルの開発に注力した。Sup35は2種類のアミロイド（Sc4、Sc37）を形成する。クライオ電子顕微鏡実験では均一な試料を調製する事が必須である。サンプルの調製方法を改良することで均一な試料を調製できていることを質量分析で確認できたので、クライオ電子顕微鏡で観測したところ、両アミロイドの構造を高分解能で決定した。この2種類のアミロイドの構造は大きく異なっており、全反射照明顕微鏡で明らかとなっていた脱凝集反応の違いを説明しうる重要な知見を得る事ができた。また、時間分解赤外分光測定およびクライオ電子顕微鏡による時間分解構造解析に向けた脱凝集反応条件の最適化のために、チオフラビンTによる脱凝集アッセイを行なった。これにより本研究で最適な反応条件を決定する事ができた。しかし、この条件でSup35アミロイド/Ssa1/Sis1複合体を調製し、クライオ電子顕微鏡で観測したが、余剰のシャペロンがクライオ電子顕微鏡画像のコントラストを低下させてしまい、構造決定には至らなかった。時間分解赤外分光測定については、アミロイドの脱凝集反応を実時間で追跡するために、高速混合マイクロフローセルを開発した。このセルを利用して時間分解赤外分光測定により脱凝集反応を観測したところ、シャペロンの構造変化に由来するタンパク質の構造変化を捉える事ができたが、アミロイドの構造変化を捉えることはできなかった。

The purpose of this study is to visualize the molecular dynamics of the deaggregation process. The basic principles of this study include: (1) determining the structure of yeast origin Sup35,(2) determining the optimum conditions for deaggregation and reaction by time-resolved infrared spectroscopy and time-resolved electron microscope particle analysis, and (3) determining the high speed mixing and development of time-resolved infrared spectroscopy. Sup35 is formed from two kinds of materials (Sc4, Sc37). Electronic micromirrors are required for uniform sample modulation. improve that modulation method of the sample and determine the structure of the sample by quality analysis The structure of these two kinds of light sources is different from that of the total reflection illumination and the micro-mirror. Time resolved infrared spectroscopy, electron microscopy, time resolved structural analysis, optimization of deaggregation conditions, and deaggregation. The optimal conditions for this study were determined. For example, if a complex of Sp 35 and Ssa1/Sis1 is modulated, the electron microscope will be used to measure the temperature, and the structure will be determined. Time resolved infrared spectroscopy is used to track and develop high-speed mixing systems. This is the first time that a person has been subjected to such a procedure.