SunTag法による脂肪細胞種固有の分化決定因子のエピゲノム制御への挑戦

2022年度は、計画①「aP2レポーター遺伝子およびSunTag-SETDB1発現細胞の作製」、および、計画②「SunTag-SETDB1によるH3K9me3を介した標的遺伝子の発現制御」の確認を予定していた。計画①では、白色脂肪前駆細胞 (3T3-L1細胞) のレポーター細胞株の樹立を試みた。網羅的遺伝子発現解析により、aP2 (Fabp4) 発現は脂肪細胞分化の比較的初期から増加することがわかっていたため、レポーターとしてはaP2プロモーターの下流にGFPを配置した配列 (paP2-GFP) を利用することとした。樹立に際し、paP2-GFPを導入したpiggyBacプラスミドを 作製し，トランスポゼースプラスミドと共に4D-Nucleofectorで導入して脂肪前駆細胞に安定発現させた後、薬剤選択によってレポーター配列が導入された細胞を選別した。得られた安定発現株を脂肪細胞分化させてGFP蛍光を経時的に観察したところ、GFP蛍光は分化開始4日後から明確に確認され、分化開始8日後でも観察された。したがって、当初の目的通りレポーター細胞株の樹立に成功した。一方、細胞間でGFP蛍光にばらつきが認められたため、当初の予定を変更し、レポーター細胞をクローニングすることとした。現在、クローニング細胞を19ライン樹立し、優良な細胞株を選定中である。計画②に関しては、本年度は実施を見送り来年度に行うこととした。

2022年度は、計画①「aP2レポーター遺伝子およびSunTag-SETDB1発現細胞の作製」、および、計画②「SunTag-SETDB1によるH3K9me3を介した標的遺伝子の発現制御」の確認を予定していた。計画①では、白色脂肪前駆細胞 (3T3-L1細胞) のレポーター細胞株の樹立を試みた。網羅的遺伝子発現解析により、aP2 (Fabp4) 発現は脂肪細胞分化の比較的初期から増加することがわかっていたため、レポーターとしてはaP2プロモーターの下流にGFPを配置した配列 (paP2-GFP) を利用することとした。樹立に際し、paP2-GFPを導入したpiggyBacプラスミドを 作製し，トランスポゼースプラスミドと共に4D-Nucleofectorで導入して脂肪前駆細胞に安定発現させた後、薬剤選択によってレポーター配列が導入された細胞を選別した。得られた安定発現株を脂肪細胞分化させてGFP蛍光を経時的に観察したところ、GFP蛍光は分化開始4日後から明確に確認され、分化開始8日後でも観察された。したがって、当初の目的通りレポーター細胞株の樹立に成功した。一方、細胞間でGFP蛍光にばらつきが認められたため、当初の予定を変更し、レポーター細胞をクローニングすることとした。現在、クローニング細胞を19ライン樹立し、優良な細胞株を選定中である。計画②に関しては、本年度は実施を見送り来年度に行うこととした。