Screening of receptors relating to cellular uptake of antibody-drug conjugate aggregates

筛选与细胞摄取抗体-药物缀合物聚集体相关的受体

基本信息

  • 批准号:
    22K15301
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.91万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
  • 财政年份:
    2022
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2022-04-01 至 2024-03-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

抗体受容体として知られるFcγ受容体(FcγR)による細胞内取込では説明しきれない抗体凝集体の細胞内取込のメカニズム解明を図るべく、抗体凝集体の細胞内取込に寄与するFcγR以外の受容体の同定に向け、Genome-wide CRISPR-Cas9 screening systemの構築ならびにスクリーニングを試みた。これまでに抗体の凝集によりFcγR非依存的な細胞内への移行量の増強が認められた細胞株に関して、蛍光標識抗体ならびにその凝集体を添加し、フローサイトメトリーにより細胞内蛍光強度を評価した。その結果、単量体の蛍光標識抗体では抗体濃度依存的に細胞内蛍光強度が増加したのに対し、凝集体添加群では一部の細胞において、低濃度作用時から非常に高い蛍光強度が認められた。そこで、本細胞株を基にCas9発現細胞株を作成し、さらにCRISPR knockout libraryをレンチウイルスで導入、薬剤選別によりGenome-wide CRISPR-Cas9 KO library systemを構築した。なお、作成したCas9発現細胞株ならびにsgRNAを発現したpooled libraryにおいても、抗体凝集体の非常に高い細胞内移行が認められた。次に、pooled libraryに蛍光標識抗体凝集体を添加し、抗体凝集体の細胞内取込が認められない画分のみをセルソーターで回収⇒細胞培養のサイクルを繰り返し、sgRNAにより抗体凝集体の取込が抑制された細胞の選別を実施した。スクリーニングの前後におけるsgRNAの発現変動をNGS解析により評価した。NGS解析の結果、抗体凝集体の細胞内取込に関与している可能性のある候補分子が複数同定されたことから、今後、同定された候補分子の抗体凝集体の細胞内取込における寄与を検証する予定である。
The intracellular extraction of antibody receptor and Fcγ receptor (FcγR) is described. The intracellular extraction of antibody aggregate is described. The intracellular extraction of antibody aggregate is described. The same direction of receptor other than FcγR is described. The construction of Genome-wide CRISPR-Cas9 screening system is described. The increase in the amount of Fcγ R-independent intracellular fluorescence was observed in cell lines, and the increase in the amount of Fc γ R-independent intracellular fluorescence was evaluated in cell lines. As a result, the intracellular fluorescence intensity of a single antibody was increased depending on the antibody concentration, and the aggregation group was increased in a part of the cells, and the intracellular fluorescence intensity was increased at low concentrations. The CRISPR knockout library was introduced into the genome, and the Genome-wide CRISPR-Cas9 KO library system was constructed. Cas9 cell line was developed and its sgRNA was detected in a pooled library. The antibody aggregates were identified in very high intracellular migration. In addition, pooled library light identification antibody aggregates, antibody aggregates in the cell extraction and recognition, cell culture and recovery, sgRNA in the antibody aggregates extraction and inhibition of cell selection and implementation The expression of sgRNA was evaluated by NGS analysis. The results of NGS analysis, the relationship between the intracellular selection of antibody aggregates and the probability of candidate molecules being identified, and the relationship between the intracellular selection of antibody aggregates and the probability of candidate molecules being identified.

项目成果

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