血友病A治療における高機能型第FVIII因子製剤の開発

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BHK細胞によるFVIII発現系を用いて変異FVIII（K1813A, K1818A, K1813A/K1818A）を作成し、変異FVIIIの比活性を測定したところ、K1813AがWild type (WT) FVIIIの約2倍の比活性を認めた。それぞれのFVIII変異体（10 nM）にトロンビン（0.4 nM）を添加し、トロンビン添加後のFVIII活性を凝固一段法で経時的に測定したところ、K1813Aにおけるトロンビン活性化後の不活化はWTより約2倍抑制されていた(K1813AとWTの減衰係数(k )はそれぞれ1.8×10-2,3.5×10-2)。次に、FVIII変異体（1nM）にトロンビン（30 nM）を添加し、FVIII活性の不活化速度を凝固一段法で経時的に測定したところ、K1813Aにおけるトロンビン活性化後の不活化はWTより約2.4倍抑制されていた(k =2.9×10-2,7.0×10-2)。これらの結果より、K1813AはWTよりA2解離速度が抑制されることが示された。K1813Aの包括的凝固能についてWTと比較検討したところ、トロンビン生成試験及びROTEMにおいて、WT 1nMとK1813A 0.5nMがほぼ同等の凝固能を示すことがわかり、K1813AはWTより2倍程度の凝固能を有することが示された。K1813AとWTをF8-Knock out (KO)マウスに投与し、凝血学的効果について尾端切断後出血量を用いて評価したところ、K1813A 2μg/kg投与時の出血量は、WT 2-4μg/kg投与時に比べて優位に低く、K1813A 1μg/kg投与時の出血量と、WT 2-4μg/kg投与時の出血量が同等であることがわかった。以上の結果から、K1813AはWTより約2-4倍程度の凝固能を有することが示された。