膜の無い構造体における蛋白質-RNA相互作用の役割の解明

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細胞内には複数の蛋白質と核酸によって形成される膜の無い構造体（MOs：Membraneless Organelles）が多数存在している。MOsの形成や機能には蛋白質-RNA相互作用が重要な役割を担っていると考えられる。本研究ではCRISPR/Cas13（Cas13）を応用した技術を活用し、MOs形成における蛋白質-RNA相互作用の役割を明らかにすることを目標とする。Cas13とBiFCを組み合わせ、293T細胞内でMOsの可視化を行った。代表的なMOsの一つであるパラスペックルを対象に、核内にMOsが形成される様子をライブセルイメージングにより観察した。また、パラスペックル形成により得られる蛍光シグナルを、FACSを用いて定量することに成功した。Cas13-BiFC融合蛋白質・ガイドRNAと遺伝子導入量の最適化を行い、シグナルノイズ比を改良した。Cas13-BiFCによって観察される蛍光シグナルが、パラスペックルの局在と一致することをRNA-FISHと蛍光免疫染色法により確認した。Cas13とNanoBiTの組み合わせでは、発光基質を加えることでパラスペックル形成を発光シグナルとして定量することに成功した。BiFCと同様に融合蛋白質・ガイドRNAと遺伝子導入量の最適化を行い、最良のシグナルノイズ比が得られるCas13-NanoBiTの確立を行った。パラスペックル形成を促進する亜ヒ酸の投与により、発光強度が増加することを確認した。Cas13とSplit-TurboIDを組み合わせて、MOsを構成する蛋白質を網羅的にビオチン化する系を確立した。Cas13-Split-TurboIDを遺伝子導入し、293T細胞内で形成されるパラスペックルの構成因子を網羅的にビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを用いて免疫沈降した。抽出された蛋白質をLC-MS/MSを用いて解析した。