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膜の無い構造体における蛋白質-RNA相互作用の役割の解明

阐明蛋白质-RNA 相互作用在无膜结构中的作用

基本信息

批准号：
22K16319
负责人：
山本圭太
金额：
$ 3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16319/
关键词：
CRISPR／Cas１３膜の無い構造体 BiFC NanoBiT split-TurboID

项目摘要

細胞内には複数の蛋白質と核酸によって形成される膜の無い構造体（MOs：Membraneless Organelles）が多数存在している。MOsの形成や機能には蛋白質-RNA相互作用が重要な役割を担っていると考えられる。本研究ではCRISPR/Cas13（Cas13）を応用した技術を活用し、MOs形成における蛋白質-RNA相互作用の役割を明らかにすることを目標とする。Cas13とBiFCを組み合わせ、293T細胞内でMOsの可視化を行った。代表的なMOsの一つであるパラスペックルを対象に、核内にMOsが形成される様子をライブセルイメージングにより観察した。また、パラスペックル形成により得られる蛍光シグナルを、FACSを用いて定量することに成功した。Cas13-BiFC融合蛋白質・ガイドRNAと遺伝子導入量の最適化を行い、シグナルノイズ比を改良した。Cas13-BiFCによって観察される蛍光シグナルが、パラスペックルの局在と一致することをRNA-FISHと蛍光免疫染色法により確認した。Cas13とNanoBiTの組み合わせでは、発光基質を加えることでパラスペックル形成を発光シグナルとして定量することに成功した。BiFCと同様に融合蛋白質・ガイドRNAと遺伝子導入量の最適化を行い、最良のシグナルノイズ比が得られるCas13-NanoBiTの確立を行った。パラスペックル形成を促進する亜ヒ酸の投与により、発光強度が増加することを確認した。Cas13とSplit-TurboIDを組み合わせて、MOsを構成する蛋白質を網羅的にビオチン化する系を確立した。Cas13-Split-TurboIDを遺伝子導入し、293T細胞内で形成されるパラスペックルの構成因子を網羅的にビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを用いて免疫沈降した。抽出された蛋白質をLC-MS/MSを用いて解析した。

Many Membraneless organelles (MOs) exist in cells where proteins and nucleic acids are formed. Protein-RNA interactions are important for MOs formation and function. The purpose of this study is to explore the use of CRISPR/Cas13 (Cas13) as a technology and to clarify protein-RNA interactions in MOs formation. Cas13 and BiFC are assembled and visualized in 293T cells. Representative MOs are selected from the target group and the core MOs are formed from the target group. For example, if you want to use FACS, you can use it to quantify your results. Optimization of Cas13-BiFC fusion protein, RNA and gene introduction, and improvement of protein ratio Cas13-BiFC was identified by RNA-FISH in the same way as Cas 13-BiFC. Cas13 and NanoBiT were successfully assembled to form a light-emitting matrix. BiFC isoform fusion protein, RNA and gene introduction quantity optimization, optimization of fusion protein ratio and establishment of Cas13-NanoBiT It is confirmed that the emission intensity of light increases due to the increase of the emission intensity of light. Cas13, Split-TurboID, MOs, and other proteins are included. Cas13-Split-TurboID gene is introduced into 293T cells, and the components of Cas 13-Split-TurboID gene are formed in 293T cells. Extraction of proteins by LC-MS/MS analysis