Elucidation of the mechanism by which exosomes released from bone-derived human bone tissue-derived mesenchymal stromal cells lead to bone formation

阐明骨源性人骨组织源性间充质基质细胞释放的外泌体导致骨形成的机制

• 批准号: 22K16990
• 负责人: 杉本 佳香
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16990/
• 关键词: エクソソーム; 骨組織由来間葉系細胞; 唇顎口蓋裂; 骨組織再生; 長期凍結保存

エクソソームの効率的かつ短時間で、簡便な精製方法を確立すべく、新たに2種類の方法を施行し比較した。培養上清はコントロールとして誘導（－）群と、骨誘導群を作成し、day 0,4,7,9,14,18,21の計7回採取し、エクソソームを精製した。細胞や細胞残渣が含まれないように、培養上清を一度1500rpm(300g程度)にて5分程度遠心し上清を回収し、0.22μmフィルターを通してから使用した。1つ目の方法はアミコンウルトラ15（メルク社）を用いて、スイングバケットローターを使用し4000gで約15-60分間回転させ、total量500μlとなるように調整した。培養上清20mlから500μｌ　1本精製された換算となり、これらのエクソソーム（Exo.）は、-80℃で保管した。2つ目の方法はDojindoのExolsolator　Exosome　Isolation　Kitを用いて行った。こちらも最終total量は500μlとなるように調整した。こちらも同様に―80℃で保管した。エクソソーム採取最終日（分化誘導後21日）に、エクソソーム採取後に骨誘導なし群と骨誘導群のフラスコをAlizarin Redで染色し、骨分化誘導群で骨（カルシウム）が形成されていることを確認した。更に保存したエクソソームの一部を用いて、定量キットFluoroCet（Funakoshi）の蛍光法で概算量を確認した。今後はウエスタンブロッティングで定性確認予定であり、また以前他の3種の方法でエクソソームの精製比較をしているため、どの方法が良いかを確立し、in vivo の実験に移行予定である。

使用了两种新方法，并将其与建立一种有效的，简短和简单的外泌体方法进行了比较。培养上清液作为对照组制备，并收集了骨诱导组七次，包括第0、4、7、9、14、18和21天，外泌体纯化。为避免含有细胞或细胞碎屑，将培养上清液以1500 rpm（约300 g）离心约5分钟以收集上清液，然后在使用前通过0.22μm的过滤器。第一种方法是使用Amicon Ultra 15（Merck），使用秋千转子制成的，并以4000 g旋转约15-60分钟，然后将总量调整为500μL。将其转换为从20 ml培养上清液中纯化的500μl纯化的一瓶，这些外泌体（EXO。）存储在-80°C下。第二种方法是使用Dojindo的Exolsolator外泌体隔离套件进行的。这也调整为最终总量500μl。这也存储在-80°C下。在外部收集的最后一天（分化诱导后的21天），外泌体收集后，用无骨诱导和骨诱导组的烧瓶用αarin红色染色，并证实在骨诱导诱导组中形成骨（钙）。此外，使用部分存储的外泌体的一部分，使用定量试剂盒荧光电脑（Funakoshi）的荧光方法确认了大约量的量。将来，我们计划使用Western印迹确认性确认，并且由于我们以前使用其他三种方法比较了外泌体纯化，因此我们将确定哪种方法更好，并继续进行体内实验。