Elucidation of the mechanism by which exosomes released from bone-derived human bone tissue-derived mesenchymal stromal cells lead to bone formation

阐明骨源性人骨组织源性间充质基质细胞释放的外泌体导致骨形成的机制

• 批准号: 22K16990
• 负责人: 杉本 佳香
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16990/
• 关键词: エクソソーム; 骨組織由来間葉系細胞; 唇顎口蓋裂; 骨組織再生; 長期凍結保存

エクソソームの効率的かつ短時間で、簡便な精製方法を確立すべく、新たに2種類の方法を施行し比較した。培養上清はコントロールとして誘導（－）群と、骨誘導群を作成し、day 0,4,7,9,14,18,21の計7回採取し、エクソソームを精製した。細胞や細胞残渣が含まれないように、培養上清を一度1500rpm(300g程度)にて5分程度遠心し上清を回収し、0.22μmフィルターを通してから使用した。1つ目の方法はアミコンウルトラ15（メルク社）を用いて、スイングバケットローターを使用し4000gで約15-60分間回転させ、total量500μlとなるように調整した。培養上清20mlから500μｌ　1本精製された換算となり、これらのエクソソーム（Exo.）は、-80℃で保管した。2つ目の方法はDojindoのExolsolator　Exosome　Isolation　Kitを用いて行った。こちらも最終total量は500μlとなるように調整した。こちらも同様に―80℃で保管した。エクソソーム採取最終日（分化誘導後21日）に、エクソソーム採取後に骨誘導なし群と骨誘導群のフラスコをAlizarin Redで染色し、骨分化誘導群で骨（カルシウム）が形成されていることを確認した。更に保存したエクソソームの一部を用いて、定量キットFluoroCet（Funakoshi）の蛍光法で概算量を確認した。今後はウエスタンブロッティングで定性確認予定であり、また以前他の3種の方法でエクソソームの精製比較をしているため、どの方法が良いかを確立し、in vivo の実験に移行予定である。

In order to ensure the accuracy of the monitoring system, such as the short-term response rate, the precision method of stool, and the new method, the new method is used for comparison. The supernatant and the supernatant were divided into four groups: the (-) group, the bone group, the day 0meme, the fourth, the ninth, the fourteen, the 21st, the seventh, the seventh, the third, the second, the second, the second, The cell residue contains the supernatant of 1500rpm (300g), the supernatant (300g), the supernatant of the heart (5), the supernatant of the heart (0.22 μ m) and the supernatant (0.22 μ m). 1. Objective method: use 4000g, about 15-60 minutes, total 500 μ l, and adjust the equipment. The supernatant 20ml