骨芽細胞分化と骨形成における線維性異形成症型GNAS変異遺伝子の機能解析

纤维异常增殖型GNAS突变基因在成骨细胞分化和骨形成中的功能分析

• 批准号: 22K17023
• 负责人: 明石 良彦
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Tokyo Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17023/
• 关键词: 線維性異形成症; GNAS遺伝子; ミスセンス変異; GNAS変異遺伝子

本研究の目的は、FDの原因であるGNAS遺伝子のミスセンス変異（R201H)が線維性結合組織の増生と骨芽細胞分化／骨形成を制御するメカニズムをin vitro実験系とin vivo移植実験系を用いて明らかにすることである。そのために、まず骨軟骨前駆細胞への分化能を保持する未分化間葉系細胞株であるC2H10T1/2細胞、骨髄間質細胞由来株であるST2細胞、骨芽細胞葉細胞株であるMC3T3-E1細胞を用いて、FD型変異型GNAS遺伝子の役割をin vitro実験系で明らかにする。FD変異型GNAS遺伝子発現細胞株の樹立のために、R201H変異あるいはR２０１C変異を導入したヒトGNAS遺伝子cDNAをIRES-GFP配列を含むレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングし、パッケージングプラスミドとともに２９３T細胞にトランスフェクションさせた。培養上清を超遠心濃縮して得たレンチウイルス粒子をC2H10T1/2細胞、ST２細胞およびMC3T3-E1細胞の各細胞に感染させた。感染させた細胞は、GFP蛍光を指標としてオールインワン蛍光顕微鏡を用いてFD変異型GNAS遺伝子発現細胞株を樹立させた。コントロール群として、FD変異型GNAS遺伝子が導入されていないempty群およびwild　type群も同様に樹立させた。in vitro実験系において、FD変異型GNAS遺伝子導入群および未導入群のC2H10T1/2細胞、ST２細胞およびMC3T3-E1細胞を得られ、現在、各細胞の細胞増殖能の変化や培養系における骨芽細胞分化の解析を開始し、その検討に着手している。

は の purpose, this study FD の reason で あ る GNAS posthumous son 伝 の ミ ス セ ン ス variations (R201H) が line d difference combining organization の raised と bone bud differentiation/bone formation を suppression す る メ カ ニ ズ ム を in vitro be と 験 department in vivo transplantation be を 験 department with い て Ming ら か に す る こ と で あ る. そ の た め に, ま ず osteochondral 駆 cells before へ の differentiation can keep す を る department of undifferentiated mesenchymal cell lines で あ る C2H10T1/2 cells, bone marrow stromal cells origin strains で あ る ST2 cells, bone cells leaves cell lines で あ る を MC3T3 E1 - cells with い て, FD - alien GNAS 伝 son の "を cut in vitro laboratory で Ming ら にする. FD - traces of alien GNAS 伝 son 発 cell lines の now set の た め に, R201H - different あ る い は R201C - different を import し た ヒ ト GNAS posthumous son 伝 cDNA を IRES - GFP match column を containing む レ ン チ ウ イ ル ス ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド に ク ロ ー ニ ン グ し, パ ッ ケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ド と と も に 293 t Cells にトラ させた スフェ ショ ショ させた させた. Enrichment culture supernatant を buzzer-beaters heart し て have た レ ン チ ウ イ ル ス particle を C2H10T1/2 cells, ST2 お よ び の MC3T3 E1 - cells each cell に infection さ せ た. Infection さ せ た cell は, GFP 蛍 を indicator light と し て オ ー ル イ ン ワ ン 蛍 light 顕 micromirror を with い て FD - traces of alien GNAS 伝 son 発 cell lines を now set さ せ た. コ ン ト ロ ー ル group と し て, FD - traces of alien GNAS 伝 son が import さ れ て い な い empty group of お よ び も wildtype group with others in に set さ せ た. in Department of vitro be 験 に お い て, FD - traces of alien GNAS 伝 son import group お よ び not import group の C2H10T1/2 cells, ST2 お よ び MC3T3 E1 cells を must ら れ, now, the cells の rights can yield の variations change や training department に お け る bone analytical を began to bud differentiation の し, そ の beg に 検 to し て い る.