Construction of high throughput neutralization assay using reporter-expressing respiratory syncytial virus

使用表达报告基因的呼吸道合胞病毒构建高通量中和测定

• 批准号: 22K17348
• 负责人: 山形 優太朗
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17348/
• 关键词: RSウイルス; 中和抗体試験; ウイルス合成; 疫学; 呼吸器感染症

培養細胞を用いたRSウイルスの感染実験および力価測定実験の系を確立した。レポーターとしてルシフェラーゼを発現する組換え体RSウイルス(rHRSV)と、市販のRSウイルス中和抗体ウサギ血清を用いて、レポーター活性の測定による中和抗体試験の条件検討を進めた。また、「ニャチャン住民コホートを用いた小児呼吸器感染症研究」のプロジェクトで採取されたRSウイルス陽性患者の鼻腔検体から抽出されたウイルスRNA(vRNA)検体を用いて、感染したRSウイルスのジェノタイピングを行った。RSウイルスのA型およびB型のG遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーDNAおよびvRNAを用いてRT-PCR反応を行い、vRNAの相補鎖DNAを増幅して電気泳動で検出した。相補鎖DNAを精製してシーケンシングにより配列を解析し、そのデータをもとに遺伝子系統樹解析を行った。結果、A型は25検体、B型は32検体で検出され、B型は32検体すべてがBA9株に近い配列を、A型は25検体中23検体がON1株に近い配列を示した。現在使用しているrHRSVはA型由来であり、抗原性の違いによりB型の検体の中和抗体活性を正確に測定できない可能性がある。この問題点を克服するため、RSウイルスのA型とB型のどちらにも利用可能な感染細胞ELISA法による中和抗体試験法を、先行研究をもとに条件検討して確立した。また、B型の検体の中和抗体試験に利用可能なrHRSVを開発するため、B型由来のウイルス膜蛋白質遺伝子を有するrHRSVのリバースジェネティクス法による合成を目指した。そのための準備として、培養したRSウイルスより抽出したvRNAからRT-PCR法により相補鎖DNAを増幅し、大腸菌を用いてプラスミドベクターにクローニングする作業を進めた。

Culture of cells with RS infection and force determination The conditions for the detection of neutralizing antibody activity in serum and serum were discussed. In the "Study of Small Respiratory Infections in the Population" section, we took samples from nasal specimens of RS positive patients and extracted RNA(vRNA) samples for use in infection. RS type A and B DNA fragments are amplified by RT-PCR and vRNA amplification. Complementary DNA purification and sequencing analysis As a result, 25 samples of type A, 32 samples of type B, 32 samples of type B, 9 samples of type A and 23 samples of type A were detected. Now use rHRSV to correctly determine the origin, antigenicity and neutralizing antibody activity of type A. This problem can be overcome by using ELISA, neutralizing antibody test and preliminary study. In addition, neutralizing antibody assays for type B models are aimed at utilizing the potential for the development of rHRSV and the synthesis of rHRSV from the membrane protein gene derived from type B using the Riflex method. The preparation, culture, extraction, and amplification of DNA by RT-PCR were carried out for Escherichia coli.