Construction of high throughput neutralization assay using reporter-expressing respiratory syncytial virus

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培養細胞を用いたRSウイルスの感染実験および力価測定実験の系を確立した。レポーターとしてルシフェラーゼを発現する組換え体RSウイルス(rHRSV)と、市販のRSウイルス中和抗体ウサギ血清を用いて、レポーター活性の測定による中和抗体試験の条件検討を進めた。また、「ニャチャン住民コホートを用いた小児呼吸器感染症研究」のプロジェクトで採取されたRSウイルス陽性患者の鼻腔検体から抽出されたウイルスRNA(vRNA)検体を用いて、感染したRSウイルスのジェノタイピングを行った。RSウイルスのA型およびB型のG遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーDNAおよびvRNAを用いてRT-PCR反応を行い、vRNAの相補鎖DNAを増幅して電気泳動で検出した。相補鎖DNAを精製してシーケンシングにより配列を解析し、そのデータをもとに遺伝子系統樹解析を行った。結果、A型は25検体、B型は32検体で検出され、B型は32検体すべてがBA9株に近い配列を、A型は25検体中23検体がON1株に近い配列を示した。現在使用しているrHRSVはA型由来であり、抗原性の違いによりB型の検体の中和抗体活性を正確に測定できない可能性がある。この問題点を克服するため、RSウイルスのA型とB型のどちらにも利用可能な感染細胞ELISA法による中和抗体試験法を、先行研究をもとに条件検討して確立した。また、B型の検体の中和抗体試験に利用可能なrHRSVを開発するため、B型由来のウイルス膜蛋白質遺伝子を有するrHRSVのリバースジェネティクス法による合成を目指した。そのための準備として、培養したRSウイルスより抽出したvRNAからRT-PCR法により相補鎖DNAを増幅し、大腸菌を用いてプラスミドベクターにクローニングする作業を進めた。