プラストシアニンの銅原子取り込み過程における分子シャペロンの役割

1. 耐塩性ラン藻Aphanothece halophyticaの分子シャペロン(DnaK)およびプラストシアニン(前駆体および成熟体)を大腸菌で発現させ、精製した。(1) 大腸菌で発現させたDnaKは、大腸菌を破壊した後、硫酸アンモニウム分画を行い、陰イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより、精製した。(2) 成熟体プラストシアニンは、大腸菌のペリプラズマ画分を回収した後、硫酸アンモニウム分画を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、精製した。(3) 前駆体プラストシアニンは、大腸菌の不溶性画分を同収した後、尿素で可溶化、尿素存在下でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、精製した。2. 精製した分子シャペロン(DnaK)の生化学的性質を検討した。耐塩性ラン藻A.halophyticaのDnaK蛋白質が現在報告されているDnaK蛋白質と同じATPase活性,蛋白質フォールディング活性を示すのかどうか検討したところ、ATPase活性,蛋白質フォールディング活性のいずれにおいても、極めて高い塩濃度(1M NaCl,KCl)でも活性を示すことが明らかになった。3. 精製したプラストシアニンへの銅原子取り込みに分子シャペロンが関与するかどうか検討した。結果、変性剤で変性させたプラストシアニンをDnaKの存在する溶液に希釈することにより銅原子取り込みが生じることを分光法で明らかにした。以上の結果について、学術論文を作成している。Molecular characterization of DnaK from a halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica for ATPase,protein folding,and copper binding under various salinity conditions, Plant Mol.Biol.,in press.(1999)

1. 耐塩性ラン藻Aphanothece halophyticaの分子シャペロン(DnaK)およびプラストシアニン(前駆体および成熟体)を大腸菌で発現させ、精製した。(1) 大腸菌で発現させたDnaKは、大腸菌を破壊した後、硫酸アンモニウム分画を行い、陰イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより、精製した。(2) 成熟体プラストシアニンは、大腸菌のペリプラズマ画分を回収した後、硫酸アンモニウム分画を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、精製した。(3) 前駆体プラストシアニンは、大腸菌の不溶性画分を同収した後、尿素で可溶化、尿素存在下でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、精製した。2. 精製した分子シャペロン(DnaK)の生化学的性質を検討した。耐塩性ラン藻A.halophyticaのDnaK蛋白質が現在報告されているDnaK蛋白質と同じATPase活性,蛋白質フォールディング活性を示すのかどうか検討したところ、ATPase活性,蛋白質フォールディング活性のいずれにおいても、極めて高い塩濃度(1M NaCl,KCl)でも活性を示すことが明らかになった。3. 精製したプラストシアニンへの銅原子取り込みに分子シャペロンが関与するかどうか検討した。結果、変性剤で変性させたプラストシアニンをDnaKの存在する溶液に希釈することにより銅原子取り込みが生じることを分光法で明らかにした。以上の結果について、学術論文を作成している。Molecular characterization of DnaK from a halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica for ATPase,protein folding,and copper binding under various salinity conditions, Plant Mol.Biol.,in press.(1999)