P型カルシウムチャンネルノックアウトマウス作製法を用いた小脳長期抑圧機構の解析

P型钙通道敲除小鼠制作方法分析小脑长期抑郁机制

基本信息

批准号：
09780760
负责人：
柴玲子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、電位依存型P型カルシウムチャンネルをCre-loxPシステムにより小脳ブルキンエ細胞で特異的に欠損させ、小脳長期抑圧におけるカルシウムイオンの役割を解析することである。本研究者はまず小脳ブルキンエ細胞に特異的に発現するP型カルシウムチャンネルのαlサブユニットのゲノミックDNAを単離し、Cre-loxPシステムを用いてES細胞に組み込むためのベクターを作製した。これをES細胞に導入してスクリーニングを行い、この遺伝子を組み込んだES細胞のクローンを得た。現在このESクローンをマウス初期胚へ導入し、キメラマウスの作製と解析を進めているところである。このノックアウトマウスを解析するためには、このチャンネルがブルキンエ細胞で欠損することによる小脳の形態形成への影響についての検討が必要であることから、プルキンエ細胞の配列に異常を起こすミュータントマウスのReeler,Yotariを用い、胎生期のプルキンエ細胞の移動に関する解析を行った。胎生13日目の正常マウス胚から小脳を分離、器官培養すると培養6日目にプルキンエ細胞は整列するが、ミュータントマウスReelerでは細胞の移動は異常であった。Reeletの小脳原基と正常マウスから分離した顆粒細胞とを供培養するとプルキンエ細胞の移動が改善された。さらに、Reeler欠損しており、正常顆粒細胞から分泌されるリーリンを定常的に分泌する細胞株L3を作製し、Reelerの小脳原基と供培養したところプルキンエ細胞の移動が改善された。そこで、さらにリーリン分子のDeletion mutantを作製し、これらのクローンによって合成される蛋白質のどの部分がプルキンエ細胞に作用してその移動を制御しているのかについて解析中である。さらに、この分子がどのようなメカニズムでプルキンエ細胞の移動に関与するのかを調べるため、in vitroで合成したリーリン分子のプルキンエ細部に対する結合実験を組織学的、生化学的に解析している。さらに、リーリン分子によるプルキンエ細胞内における情報伝達経路についてmDab-1のリン酸化およびその結合蛋白の観点から解析中である。

这项研究的目的是使用CRE-LoxP系统特别缺乏小脑Brukinje细胞中电压依赖性的P型钙通道，并分析钙离子在长期小脑抑制中的作用。研究人员首先分离了P型钙通道的αL亚基的基因组DNA，该基因在小脑Brukinje细胞中特异性表达，并使用CRE-LOXP系统创建了一个载体，用于整合到ES细胞中。将其引入ES细胞并进行筛选以获得掺入该基因的ES细胞的克隆。 ES克隆已被引入早期小鼠胚胎中，目前正在对嵌合小鼠进行生产和分析。为了分析这些基因敲除小鼠，有必要研究该通道缺陷对小脑形态发生的影响，因此我们使用了一种突变的小鼠，这是一种突变的小鼠，在purkinje细胞中导致异常，并在胚胎生命期间分析purkinje细胞的迁移。当在胚胎和器官培养的第13天从正常小鼠胚胎中分离出小脑时，在培养的第6天对齐Purkinje细胞时，但在突变小鼠卷轴中细胞迁移异常。当从正常小鼠中分离出Reelet和颗粒细胞的小脑原始细胞时，Purkinje细胞的迁移得到了改善。此外，生产并用Reeler的小脑原始培养了从正常颗粒细胞分泌的Reeler和不断分泌的Reelin的细胞系L3改善了Purkinje细胞的迁移。因此，我们进一步产生了reelin分子的缺失突变体，目前正在分析这些克隆合成的蛋白质的哪一部分作用于Purkinje细胞并控制其迁移。此外，为了研究浦肯野细胞迁移所涉及的机制，我们在组织学和生物化学上在组织学和生化上分析了体外合成卷蛋白分子的组织学和生化结合实验，以向purkinje细节进行分析。此外，目前正在从MDAB-1磷酸化及其结合蛋白的角度分析purkinje细胞中的信号传导途径。