P型カルシウムチャンネルノックアウトマウス作製法を用いた小脳長期抑圧機構の解析

P型钙通道敲除小鼠制作方法分析小脑长期抑郁机制

• 批准号: 09780760
• 负责人: 柴 玲子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780760/
• 关键词: カルシウムチャンネル; 小脳長期抑圧; プルキンエ細胞; ノックアウトマウス; リーリン; mDab-1; プルキニエ細胞

本研究の目的は、電位依存型P型カルシウムチャンネルをCre-loxPシステムにより小脳ブルキンエ細胞で特異的に欠損させ、小脳長期抑圧におけるカルシウムイオンの役割を解析することである。本研究者はまず小脳ブルキンエ細胞に特異的に発現するP型カルシウムチャンネルのαlサブユニットのゲノミックDNAを単離し、Cre-loxPシステムを用いてES細胞に組み込むためのベクターを作製した。これをES細胞に導入してスクリーニングを行い、この遺伝子を組み込んだES細胞のクローンを得た。現在このESクローンをマウス初期胚へ導入し、キメラマウスの作製と解析を進めているところである。このノックアウトマウスを解析するためには、このチャンネルがブルキンエ細胞で欠損することによる小脳の形態形成への影響についての検討が必要であることから、プルキンエ細胞の配列に異常を起こすミュータントマウスのReeler,Yotariを用い、胎生期のプルキンエ細胞の移動に関する解析を行った。胎生13日目の正常マウス胚から小脳を分離、器官培養すると培養6日目にプルキンエ細胞は整列するが、ミュータントマウスReelerでは細胞の移動は異常であった。Reeletの小脳原基と正常マウスから分離した顆粒細胞とを供培養するとプルキンエ細胞の移動が改善された。さらに、Reeler欠損しており、正常顆粒細胞から分泌されるリーリンを定常的に分泌する細胞株L3を作製し、Reelerの小脳原基と供培養したところプルキンエ細胞の移動が改善された。そこで、さらにリーリン分子のDeletion mutantを作製し、これらのクローンによって合成される蛋白質のどの部分がプルキンエ細胞に作用してその移動を制御しているのかについて解析中である。さらに、この分子がどのようなメカニズムでプルキンエ細胞の移動に関与するのかを調べるため、in vitroで合成したリーリン分子のプルキンエ細部に対する結合実験を組織学的、生化学的に解析している。さらに、リーリン分子によるプルキンエ細胞内における情報伝達経路についてmDab-1のリン酸化およびその結合蛋白の観点から解析中である。

は の purpose, this study potential dependent type P type カ ル シ ウ ム チ ャ ン ネ ル を Cre - loxP シ ス テ ム に よ り small 脳 ブ ル キ ン エ cells で specific に owe loss さ せ, small 脳 long-term suppression 圧 に お け る カ ル シ ウ ム イ オ ン の service cut を parsing す る こ と で あ る. The researchers は ま ず small 脳 ブ ル キ ン エ cells に specific に 発 now す る p-type カ ル シ ウ ム チ ャ ン ネ ル の alpha l サ ブ ユ ニ ッ ト の ゲ ノ ミ ッ ク DNA を 単 し, Cre - loxP シ ス テ ム を with い て ES cells に group み 込 む た め の ベ ク タ ー を cropping し た. こ れ を ES cells に import し て ス ク リ ー ニ ン グ を い, こ の heritage 伝 son を group み 込 ん だ ES cells の ク ロ ー ン を た. Now こ の ES ク ロ ー ン を マ ウ ス へ import し early embryogenesis, the キ メ ラ マ ウ ス の cropping と parsing を into め て い る と こ ろ で あ る. こ の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を parsing す る た め に は, こ の チ ャ ン ネ ル が ブ ル キ ン で owe エ cell loss す る こ と に よ る small 脳 の morphogenetic へ の influence に つ い て の beg が 検 necessary で あ る こ と か ら, プ ル キ ン エ cell abnormal の match column に を こ す ミ ュ ー タ ン ト マ ウ ス の Reeler, Yotari を い, child In the biological stage, there are <s:1> プ キ キ エ エ エ cell <s:1> movement に related する analysis を rows った. Viviparous 13 mu の normal マ ウ ス embryo か ら small 脳 を isolation, organ culture す る と training 6 mesh に プ ル キ ン エ cells は whole column す る が, ミ ュ ー タ ン ト マ ウ ス Reeler で は の cell abnormal は で あ っ た. Small Reelet の 脳 primordium と normal マ ウ ス か ら separation し た granulosa cells と を for cultivating す る と プ ル キ ン エ の cell が improve さ れ た. さ ら に, Reeler owe damage し て お り, normal granular cell か ら secretion さ れ る リ ー リ ン を constant に secretion す る cell lines L3 を as し, Reeler の small 脳 primordium と for cultivating し た と こ ろ プ ル キ ン エ の cell が improve さ れ た. そ こ で, さ ら に リ ー リ ン molecular の Deletion mutant を as し, こ れ ら の ク ロ ー ン に よ っ て synthetic さ れ る protein の ど の part が プ ル キ ン エ cells に し て そ の mobile を suppression し て い る の か に つ い て in parsing で あ る. さ ら に, こ の molecular が ど の よ う な メ カ ニ ズ ム で プ ル キ ン エ の cell に masato and す る の か を adjustable べ る た め, the in vitro で synthetic し た リ ー リ ン molecular の プ ル キ ン エ detail に す seaborne る combination be 験 を histology, biochemistry に parsing し て い る. さ ら に, リ ー リ ン molecular に よ る プ ル キ ン エ intracellular に お け る intelligence 伝 da 経 road に つ い て mDab - 1 の リ ン acidification お よ び そ の binding protein の 観 point か ら parsing で あ る.

项目成果

Matsui H,Murata Y,Hirano K,Sasaki T,Shiba R et al.: "Hydrogen peroxide-induced cellular injury is associated with increase in endogenous fluorescence from rat gastric mucosal epithelial cell culture : A new method for detecting oxidative cellular injury b

Matsui H,Murata Y,Hirano K,Sasaki T,Shiba R 等人：“过氧化氢诱导的细胞损伤与大鼠胃粘膜上皮细胞培养物的内源性荧光增加有关：一种检测氧化细胞损伤的新方法

Matsui H, Shiba R et al.: "Direct detection of hepatitis B virus gene integrated in the Alexander cell using fluorescence in situ polymerase chain reaction." Cancer Letter. 116・2. 259-264 (1997)

Matsui H、Shiba R 等人：“使用荧光原位聚合酶链反应直接检测整合在 Alexander 细胞中的乙型肝炎病毒基因”116・2（1997 年）。

Matsui H, Murata Y, Hirano K, Sasaki T, Shiba R et al.: "Hydrogen peroxide-induced cellular injury is associated with increase in endogeneous fluorescence from rat gastric mucosal epitherial cell culture" Journal of Gasteroenterology. (in press). (1998)

Matsui H、Murata Y、Hirano K、Sasaki T、Shiba R 等人：“过氧化氢诱导的细胞损伤与大鼠胃粘膜上皮细胞培养物的内源性荧光增加有关”胃肠病学杂志。

R.Shiba,K.Nakajima,T.Miyata,M.Ogawa and K.Mikoshiba: "Rescue of Purkinje cell migration in the reeler cerebellum in vitro by exogenous CR-50 antigen/Reelin" Bulletin of the Japanese Society for Neurochemistry. 37・3. 553-553 (1998)

R. Shiba、K. Nakajima、T. Miyata、M. Okawa 和 K. Mikoshiba：“外源性 CR-50 抗原/Reelin 体外拯救 reeler 小脑中的浦肯野细胞迁移”日本神经化学学会通报 37。・3。553-553（1998）

Liu SQ,Kawai K,Shiraiwa H,Hayashi H,Akaza H,Hashizaki K,Shiba R et al.: "High rate of induction of human autologous cytotoxic T lymphocytes against renal carcinoma cells cultured with an interleukin cocktail." Japanese Journal of Cancer Research. 89・11. 1

Liu SQ、Kawai K、Shiraiwa H、Hayashi H、Akaza H、Hashizaki K、Shiba R 等人：“用白细胞介素混合物培养的人自体细胞毒性 T 淋巴细胞对肾癌细胞的高诱导率。”研究89·11.1