アミラーゼの新規なデンプン結合領域の構造と機能

淀粉酶新型淀粉结合区的结构和功能

• 批准号: 10760058
• 负责人: 炭谷 順一
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760058/
• 关键词: starch-binding domain; α-Amylase; Bacillus; repeat sequence; site-directed mutagenesis; amylase

Bacillus sp.No.195株の生産する動物型アミラーゼ(BAA)はC末端領域に90アミノ酸残基からなる繰り返し配列が存在し,これが新規なstarch-binding domain(SBD)として機能することがわかっている.本研究では,このSBDの構造機能相関について解明することを目標として,今回は本SBDおよびそのホモログに保存されている,1繰り返し単位当たり2ヶ所ずつ存在するTrp残基(Trp-485,Trp-523,Trp-586,Trp-625)に部位特異的変異をそれぞれもしくは複数箇所導入することでデンプン結合に関与するアミノ酸残基の同定を試みた.変異の導入はPCRを利用したメガプライマー法にて行った.変異が導入されたSBDをコードする領域を発現ベクターpET16bのT7プロモーター下流に連結し,SBDがHis-tagとの融合蛋白として発現するように発現プラスミドを構築した.これを大腸菌JM109(DE3)株に導入することで菌体内にインクルージョンボディとして大量に発現させた.無細胞抽出液からインクルージョンボディを遠心分離によって回収し,8M尿素によって可溶化後,Ni-chelating Sepharoseにアフィニティ吸着し,尿素を逆グラジエントで除くことによってリフォールディングを行い,且つ電気泳動的に均一な標品を得ることに成功した.上記のように調製した変異SBDを用いて生デンプンに対する結合定数K_aおよび最大結合量B_<max>を算出した結果,繰り返し単位それぞれのN末端側に高度に保存されたTrp(Trp-485,Trp-586)がスターチへの結合に重要な役割を果たしており,C末端側に高度に保存されているTrp(Trp-523,Trp-625)も補助的な役割ながら,スターチとの結合に大きく貢献していることが示唆された.

Bacillus sp.No.195 plant biodegradable chemicals (BAA), C-terminal domain, 90%, acid residues, acid residues, acid residues In this study, the SBD machine can be used to understand the performance of the computer. This time, the SBD machine is responsible for saving the data and returning to the location where the Trp residue (Trp-485,Trp-523,Trp-586) exists in the cluster 2. Trp-625) in the special part of the body, the number of the complex data is not the same as that of the acid residue in the compound. Please enter the PCR and use this method to make sure that you do not know what to do. In the field of SBD, we need to see that pET16b, T7, SBD, His-tag, fusion protein, fusion protein, protein, The strain of JM109 (DE3) was introduced into the body of the fungus. The cell extraction solution was separated from each other. After the 8m urea solution was dissolved, the Ni-chelating Sepharose was adsorbed. The urea solution was used to remove the environmental pollution, and the uniform label of the electrophoretic electrophoretic test was successfully detected. In the last chapter, we combined the fixed number, the maximum combination quantity, the maximum combination quantity, the maximum combination quantity In order to calculate the results of the experiment, the results were calculated, and the results were calculated. The results show that the height of the Trp (Trp-485,Trp-586) in the N-terminal, the height in the C-terminal, the height in the N-terminal, the height in the N-terminal, the height, the height.