アミラーゼの新規なデンプン結合領域の構造と機能

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Bacillus sp.No.195株の生産する動物型アミラーゼ(BAA)はC末端領域に90アミノ酸残基からなる繰り返し配列が存在し,これが新規なstarch-binding domain(SBD)として機能することがわかっている.本研究では,このSBDの構造機能相関について解明することを目標として,今回は本SBDおよびそのホモログに保存されている,1繰り返し単位当たり2ヶ所ずつ存在するTrp残基(Trp-485,Trp-523,Trp-586,Trp-625)に部位特異的変異をそれぞれもしくは複数箇所導入することでデンプン結合に関与するアミノ酸残基の同定を試みた.変異の導入はPCRを利用したメガプライマー法にて行った.変異が導入されたSBDをコードする領域を発現ベクターpET16bのT7プロモーター下流に連結し,SBDがHis-tagとの融合蛋白として発現するように発現プラスミドを構築した.これを大腸菌JM109(DE3)株に導入することで菌体内にインクルージョンボディとして大量に発現させた.無細胞抽出液からインクルージョンボディを遠心分離によって回収し,8M尿素によって可溶化後,Ni-chelating Sepharoseにアフィニティ吸着し,尿素を逆グラジエントで除くことによってリフォールディングを行い,且つ電気泳動的に均一な標品を得ることに成功した.上記のように調製した変異SBDを用いて生デンプンに対する結合定数K_aおよび最大結合量B_<max>を算出した結果,繰り返し単位それぞれのN末端側に高度に保存されたTrp(Trp-485,Trp-586)がスターチへの結合に重要な役割を果たしており,C末端側に高度に保存されているTrp(Trp-523,Trp-625)も補助的な役割ながら,スターチとの結合に大きく貢献していることが示唆された.