鶏脂肪細胞リポプロティンリパーゼ遺伝子のクローニングとその発現制御領域の解明

鸡脂肪细胞脂蛋白脂肪酶基因的克隆及其表达控制区的阐明

基本信息

批准号：
10760158
负责人：
佐藤幹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760158/
关键词：
リポプロテインリパーゼ鶏脂肪蓄積 cDNAクローニング

项目摘要

脂肪過剰蓄積のメカニズムの解明とその制御法の開発を目標として、脂肪組織での主要な脂肪蓄積調節酵素であるリポプロテインリバーゼ(LPLase)の遺伝子・蛋白質発現機構を明らかにすることを目的とした。本年度は、鶏脂肪細胞培養系の作成と脂肪組織LPLase cDNAのクローニングを行なった。(1) 鶏脂肪細胞培養系の作成無菌的に採取した7日齢ブロイラー雛の脂肪組織を供試し、酵素消化法により脂肪前駆細胞を調製した。鶏脂肪前駆細胞は10%FBSを含むM199(Growth medium)で増殖し、Growth mediumに10mM Glucose、200μg/ml Insulin、250nM Dexamethason、33μM biotin、17μM pantothenaeおよび1mM oleic acidを添加すると24時間後に脂肪滴を有する脂肪細胞に分化した。分化した脂肪細胞は、細胞内にトリグリセリドを蓄積し、LPLase活性およびVLDL receptor、LeptinのmRNAを発現しており、鶏の脂肪蓄積機構を分子生物学的に解析するのに適した細胞であることが確認された。(2) 脂肪細胞LPLaseのcDNAクローニングまず、LPLase発現の活発な鶏脂肪細胞のcDNAライブラリー(ベクター:pBluescript II KS+)を作成した。次に、ブロイラー精製LPLaseのアミノ酸配列よりプローブを作成し、cDNAライブラリーを用いたコロニーハイブリダイゼーションで完全長のcDNAをクローニングすることに成功した。ブロイラーLPL cDNAは2,297bpで、490個のアミノ酸をコードしていた。また、鶏LPLのタンパク質部分の推定分子量は52,601、等電点は7.91と推定され、糖鎖付加を経て活性を持つ成熟LPLとなることが推測された。

为了阐明过量积累的机制并开发了一种控制它的方法，目的是阐明脂蛋白回现的基因和蛋白质表达机制（Lplase），这是脂肪组织中的主要脂肪积累调节酶。今年，我们创建了鸡肉脂肪细胞培养系统和克隆的脂肪组织LPLASE cDNA。（1）对鸡脂肪细胞培养系统的产生进行了无菌测试的7天大肉鸡小鸡的脂肪组织，并通过酶促消化制备脂肪祖细胞。 Chicken fat precursor cells were grown in M199 (Growth medium) containing 10% FBS and differentiated into lipid-drip-bearing adipocytes 24 hours after addition of 10 mM Glucose, 200 μg/ml Insulin, 250 nM Dexamethason, 33 μM biotin, 17 μM pantothenae and 1 mM oleic acid to Growth medium.分化的脂肪细胞在细胞中积聚甘油三酸酯，表达LPLASE活性，VLDL受体和瘦素mRNA，并已确认适合于鸡脂肪积累机制的分子生物学分析。（2）创建了具有活性LPLASE表达的鸡脂肪细胞的脂肪细胞Lplase的cDNA克隆，cDNA库（vector：vector：pbluescript ii ks+）。接下来，从肉鸡纯化的Lplase的氨基酸序列中制备探针，并使用cDNA库通过菌落杂交成功克隆了全长cDNA。肉鸡LPL cDNA为2,297 bp，编码490个氨基酸。此外，鸡肉LPL蛋白质部分的估计分子量估计为52,601，估计等电点为7.91，并且估计蛋白质部分通过糖基化活性。