細胞老化関連遺伝子の探索とその解析

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チミジン類似体のブロモデオキシウリジンは、正常細胞および不死化細胞の両者において速やかに、かつ同調的に細胞老化を誘導する。細胞老化関連遺伝子のカタログ化、各遺伝子の細胞老化における役割および遺伝子の共通の発現調節機構の解明を目的として、ブロモデオキシウリジンで発現が上昇する遺伝子をサブトラクション-ディファレンシャルハイブリダイゼーション法により分離し、さらにその中で正常細胞の老化過程で発現が上昇するものの選択を行い、老化関連遺伝子の収集を行っている。昨年度は、HeLa細胞のブロモデオキシウリジン処理で誘導される42種類の遺伝子を分離し、約2/3は正常細胞の老化で誘導されること報告した。そこで本年度は、規模を10倍に上げてスクリーニングを行った。まず、ブロモデオキシウリジン処理で発現が上昇する遺伝子を濃縮したライブラリーより、任意の12,000クローンについてディファレンシャルハイブリダイゼーション解析を行い、約900クローンに候補を絞った。次いで、各クローンの挿入断片をPCR増幅し、ナイロン膜上にスポットしてcDNAマクロアレイを作製し、Rl標識一本鎖cDNAを用いて発現量を調べた。4日間のブロモデオキシウリジン処理により2倍以上発現が上昇した約500クローンについて塩基配列を決定し、BLAST解析を行った。その結果、316種類のブロモデオキシウリジン誘導遺伝子を新たに同定した。予備的実験の段階では、うち219種類が正常細胞の老化で誘導された。今後、収集した遺伝子よりcDNAマクロアレイを新たに作製し、不死化細胞のブロモデオキシウリジン処理、および正常細胞の老化による発現量の変化の半定量的解析を行い、論文にまとめる予定である。またこのアレイを用いて、活性酸素、その他のストレスによる細胞老化での発現変化も調べ、ストレスによる老化と複製老化との違いについて、また老化診断への応用の可能性も調べたい。