カルシウムに対する高親和性・新規EF―hand蛋白質の三次元構造解析

新型高钙亲和力 EF-hand 蛋白的三维结构分析

• 批准号: 12780531
• 负责人: 中村 彰男
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780531/
• 关键词: カルシウム; EF-hand; 結晶化; 三次元構造解析; フィザルム; カルシウム結合蛋白質; 組み替え体蛋白質; EF-hand蛋白質; X線構造解析; 三次元構造; 真性粘菌; α-helix; 分子内相互作用

平成12年度はΔN32CBP40のカルシウム非存在下での構造解析を分解能3.0Aで解析し、構造精密化により三次元構造を明らかにすることができた。13年度はカルシウム存在下での結晶化を幾度か試みたが結晶化は困難であった。そこでカルシウムをソーキング(浸透)して得られた回折強度データを用いて、差フーリエ法によりカルシウム結合状態の構造解析を行った。カルシウム非結合の構造とカルシウム結合の構造の変化はカルモジュリンの様に大きくはなかった。一つは結晶内分子間パッキングの影響で、構造変化が抑制されてしまった可能性があるが、ΔN32CBP40は、EF1/2とEF3/4の間にカルモジュリンのようなリンカーがないため、もともと両者が相互作用してコンパクトな構造になっているので、カルシウムを結合しても大きな構造変化が起こらない可能性がある。このΔN32CBP40が非常に高いカルシウムに対する親和性を持っているのは、カルシウムN末端のαヘリックスからなるcoiiled-coilドメインと球状のEF-handドメインの部分がは広範囲にわたって分子内相互作用することによるものであることも構造からわかった。さらに、カルシウムによる自己集合に関しても、確かにカルシウムを結合したときの構造変化は少ないものの、ΔN32CBP40のN末端のcoiled-coilでは、1本目のヘリックスが2本目に比べて短い。しかし、二次構造予測からは、32残基が加わると2本のヘリックスの長さがそろい、coiled-coilが安定化・長くなると予想される。そのメカニズムはCBP40全長にカルシウムが結合すると、EF-handの構造変化がドメイン間相互作用を介してcoiled-coilに伝わり、coiled-coilのヘリックス間の相対配置が変化し、それによって、分子間でcoiled-coil同士がバンドルを作って会合するのではないだろうかと考えられる。本研究で得られたデータは現在Nature Structural Biologyに投稿中である。また、更にΔN32CBP40とCaMのキメラについても結晶を得ることができ、現在構造解析中である。

Pp.47-53 12 は Δ N32CBP40 の カ ル シ ウ ム the presence of で の structure を decomposition can 3.0 A で analytical し, construct motors に よ り three yuan structure を Ming ら か に す る こ と が で き た. In the year 2013, there were several times of <s:1> カ シウム シウム シウム that the で <s:1> crystallized を and several times that the みたが crystallized であった was difficult であった. そ こ で カ ル シ ウ ム を ソ ー キ ン グ (soaked) し て have ら れ た inflexion strength デ ー タ を with い て, difference フ ー リ エ method に よ り カ ル シ ウ ム combining state の structure line を っ た. カ ル シ ウ ム nonassociative の tectonic と カ ル シ ウ ム combined with の の variations change は カ ル モ ジ ュ リ ン の others に big き く は な か っ た. Within a つ は crystallization intermolecular パ ッ キ ン グ の affect が で, structure - inhibiting さ れ て し ま っ た possibility が あ る が, Δ N32CBP40 は, EF1/2 と EF3/4 between の に カ ル モ ジ ュ リ ン の よ う な リ ン カ ー が な い た め, も と も と struck the が interaction し て コ ン パ ク ト な tectonic に な っ て い る の で, カ ル シ Youdaoplaceholder0, in combination with て て, the large な な tectonic variation が gives rise to the possibility of <s:1> らな らな がある. Very high に い こ の Δ N32CBP40 が カ ル シ ウ ム に す seaborne る affinity を hold っ て い る の は, カ ル シ ウ ム N terminal の alpha ヘ リ ッ ク ス か ら な る coiiled - coil ド メ イ ン と globular の EF - hand ド メ イ ン の part が は hiroo van 囲 に わ た っ て intramolecular interaction す る こ と に よ る も の で あ る The structure of った と らわ った った. さ ら に, カ ル シ ウ ム に よ る his collection に masato し て も, indeed か に カ ル シ ウ ム を combining し た と き の structure - the less は な い も の の, Δ N32CBP40 の N terminal の coiled - coil で は, 1 this item の ヘ リ ッ ク ス が 2 this item に than べ て short い. し か し, secondary structure can be か ら は, 32 residues が わ る と 2 this の ヘ リ ッ ク ス の long さ が そ ろ い, coiled coil が stabilization, long く な る と to think さ れ る. そ の メ カ ニ ズ ム は CBP40 span に カ ル シ ウ ム が combining す る と, EF - hand の structure - the が ド メ イ ン を interface interaction between し て coiled - coil に 伝 わ り, coiled coil の ヘ リ ッ ク ス の phase between configuration seaborne が - し, そ れ に よ っ て, intermolecular で coiled coil With James が バ ン ド ル を as っ て rendezvous す る の で は な い だ ろ う か と exam え ら れ る. This study で obtained られたデ タ タ タ is now in Nature Structural Biologyに submission である. ま た, more に Δ N32CBP40 と CaM の キ メ ラ に つ い て も crystallization を have る こ と が で き, now in the structural analysis で あ る.

项目成果

Onozawa, K. et al.: "Tissue distribution of capsaicin receptor in the various organs of rats"Proc. Japan Acad.. 76,Ser B. 68-72 (2001)

Onozawa, K. 等人：“大鼠各器官中辣椒素受体的组织分布”Proc。

Iwasaki,W.: "Crystallization and preliminary X-ray Diffraction studies of a 40 kDa calcium Binding Protein specifically expressed in plasmodia of Physarum polycephalum."J.Biochem.. 126. 7-9 (1999)

Iwasaki,W.：“多头绒泡菌中特异表达的 40 kDa 钙结合蛋白的结晶和初步 X 射线衍射研究。”J.Biochem.. 126. 7-9 (1999)

Kohama, K. et al.: "Targeting of myosin light chain kinase in vascular smooth muscle cells, and its implication for drug discovery"Nippon Yakurigaku Zasshi.. 118. 269-276 (2001)

Kohama, K. 等人：“血管平滑肌细胞中肌球蛋白轻链激酶的靶向及其对药物发现的意义”Nippon Yakurigaku Zasshi.. 118. 269-276 (2001)

Kishi H.et al.: "Stable transfectants of smooth muscle cell line lacking the expression of myosin light chain kinase and their characterization with respect to the actomyosin system"J. Biol. Chem.. 275. 1414-1420 (2000)

Kishi H.等人：“缺乏肌球蛋白轻链激酶表达的平滑肌细胞系的稳定转染子及其关于肌动球蛋白系统的表征”J.

Gao, Y. et al.: "Myosin light chain kinase as a multifunctional regulatory protein of smooth muscle contraction"IUBMB Life.. 51. 337-344 (2001)

高，Y.等人：“肌球蛋白轻链激酶作为平滑肌收缩的多功能调节蛋白”IUBMB Life.. 51. 337-344 (2001)