チトクロムP450のN末付近プロリンリッチモチーフの構造安定性及び活性への影響

细胞色素 P450 N 末端附近富含脯氨酸的基序对结构稳定性和活性的影响

• 批准号: 19923058
• 负责人: 本多 秀俊
• 金额: $ 0.48万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19923058/
• 关键词: チトクロムP450; 遺伝子多型; 熱安定性

【研究目的】本研究では、チトクロムP450(CYP)2D6の変異遺伝子のひとつであるCYP2D6*10(34番目のプロリンがセリンに置換)によりコードされる酵素は活性の低下と共に野生型に比べ熱に対する安定性が低下すること、34番目以降の十数アミノ酸は、ヒトCYP(CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等)において、プロリンの多い高度に保存されたドメイン(プロリンリッチモチーフ、PRM)を形成していることから、N末付近のPRMは、ヒトCYPの正常な機能発現に重要であり、ここに変異が入ることで分子全体の安定性、膜への配向性あるいは発現量が変化する可能性を想定し、ヒトCYPの活性、熱安定性及び発現量に対するPRMの影響を明らかにすることを目的として検討を行った。【研究方法】市販のヒト肝mRNAを基に、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5のcDNAをクローニングし、それぞれのPRM中のプロリンをアラニンに変異させた変異型cDNAを構築した。構築した野生型および変異型CYP遺伝子をP450還元酵素と直列に連結して酵母発現用ベクターにサブクローニングし、酵母菌に感染させた。感染させた酵母菌よりミクロソームを調製し、標準化合物を用いて活性の検討を行った。【研究結果】遺伝子導入方法・導入試薬等の条件検討を行ったが、現時点ではCYP mRNAの発現は認められず、本研究の目的を達成するに十分な酵素活性を有するミクロソームを得るに至っていない。ウエスタンブロット等を利用したタンパク質レベルでの発現確認は実施していないが、CYPが発現していない可能性が高く、さらに実験条件を最適化することが必要と考えられた。今後、最適実験条件を決定し、CYPの熱安定性の検討を推進していく予定である。

[Objective] This study was conducted to investigate P450(CYP)2D6 and CYP2D 6*10.(34) The enzyme activity in the wild type is lower than that in the wild type, and the stability in the wild type is lower than that in the wild type.(CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, etc.) Since the formation of N-terminal PRMs, N-terminal PRMs are important for the normal functional development of primary CYPs, this makes it possible to determine the stability of the entire molecule, the alignment of the membrane, the possibility of changes in the amount of discovery, and the impact of PRMs on the activity, thermal stability, and amount of discovery of primary CYPs. [Methods] Construction of cDNA for CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, CYP2D6, CYP2C19, CYP2C19, Construction of wild-type and heterotypic CYP genes P450-reducing enzymes and in-line linkages for yeast development and yeast infection A study of the activity of standard compounds in yeast infection was conducted. [Results] The gene introduction method, introduction test and other conditions were discussed, and CYP mRNA expression was recognized at the present time. The objectives of this study were achieved. It is necessary to confirm the occurrence of CYP by using the above method. The probability of CYP occurrence is high. The condition of CYP occurrence is optimized. In the future, the optimum conditions for the determination of CYP thermal stability will be determined.