脳腫瘍圧挫標本を用いたFISH法による脳腫瘍遺伝子診断法の開発

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【研究目的】近年、神経膠腫の中で乏突起膠腫,退形成乏突起膠腫では化学療法に対する感受性が高く生命予後が良好であることが報告されている。これらは遺伝子診断による分類が有用という報告もあり、WHOでは1pのLOHがあると報告され、高い化学療法感受性、予後の延長との相関も報告されている。その遺伝子診断法の一つとして病理組織標本を用いたFISH法があるが、組織標本では切片の厚さによりsignalが消失し偽陰性化するという報告もある。腫瘍細胞がスライスされずsignalを得ることができれば偽陰性化を防ぐことができると考えられ、脳腫瘍圧挫標本(細胞診スメア標本)を用いることにより、偽陰性化を攻略したFISH法が可能と考える。【研究方法】1.細胞診標本をパパニコロウ染色後、細胞像を観察しデジタル画像として保存した後、カバーガラスを剥がし1p36を用いたFISH法を行いsignal解析する。2.脳腫瘍細胞診スメア未染標を用いFISH反応後に一次抗体GFAPを反応させ、蛍光色素であるTEXAS REDで発色する。この重染色をおこない、腫瘍細胞のみのsignalを観察する。【研究成果】1.パパニコロウ染色標本を観察し、目的の細胞を細胞転写後、FISHを行い解析した。転写後、パパニコロウ染色の脱色操作なしでも十分にsignal観察可能な標本であった。また、目的の細胞に対して的確に1p36のLOH観察が可能であり、パラフィン切片を用いたFISHよりも前処理操作が少なくHybridization時間も短縮することができたことから、本研究により通常業務の検査法の一つとして確立することができた。しかし、細胞診スメア標本を用いた場合、細胞学的に特徴的形態、細胞配列をみる腫瘍に対しては有効な手法であるが、乏突起膠腫,退形成乏突起膠腫では細胞形態のみでの診断が困難な場合が多く、その場合には同時にパラフィン組織標本を用いたFISH解析が必要であると考えられた。2.蛍光免疫細胞化学染色にてglia系細胞の細胞質がTEXAS REDで発色され、FISH反応のsignalの減弱もなく、標本作製可能であった。しかし、signal観察時に蛍光色素であるTEXAS RED、SpectrumOrangeの蛍光色調が類似しているため、SpectrumOrangeフィルターによる観察が難しく、SpectrumGreen、SpectrumOrangeを用いた同時観察においても解析し難い結果となった。