黒色真菌フィアロホーラ・ベルコーサの疫学検証法の開発と検証

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皮膚病変から単離されたPhialophora verrucosaは,本来は木材腐朽菌である。本菌による新興再興感染症原因菌としての報告も増加傾向にある。予防・治療・経済貢献が期待される遺伝子レベルによる疫学検証は重要課題で,rDNA全領域における塩基配列の詳細解析から,下記の3つのアプローチを疫学指標として検討を試み、有用な知見が得られた。遺伝学的同定(D1/D2領域)が確認できた34菌株を対象とした.(1)高変異性のIGS領域の詳細構造から導いた、モチーフ様構造のリピート配列をもったVIR領域に焦点をあてた株識別で,検証を試みた。解析した12株の配列からリピートエレメント構成の違いにより電気泳動での分離解析が可能な3種のタイプ(VIRI, VIRII, VIRIII)に類別できた為、本領域増幅primerを設計し,6カ国の分離株61株について増幅を試みた。アガロースゲル上500～800bpに異なる3タイプが,VIRI:13%, VIRII:33%, VIRIII:54%の割合で検出できた。自然界分離株ではVIRIIIが最も多く,地域的な傾向が認められた一方、ヒトはあらゆる場所での感染遭遇が推察できる様にヒト由来の全7株からは3タイプが特徴的に検出された。樹木分離株が周辺土壌分離株と同一タイプであった結果も一部で得られ、IGSが疫学指標になり得る事を示唆した。(2)33株の18S rRNA遺伝子の塩基配列解析から、85%の株にintronの存在が認められた。5 sitesに仮称intron-A,B,C,D,Eの存在があり、HEGが挿入された株も存在した。Subgroup解析により4 sitesにIE(S 516, S 1199)とIC1(S 943, S 1506)を推定した(未同定)。株毎のsites, subgroupからintron typingを行った結果、分離地域と相関する傾向が認められた。(3)28S rRNAの配列解析を5株で行い,3 sitesに挿入のintronについて疫学指標としての検証とintronの同定を行った.5株はdirect sequencingを行い,最短3914,最長4698bpの塩基配列が解析できた.これら菌株中3 sitesにintron領域,仮称intron-F, G, Hの存在が推測された為,各intron増幅用primerを作成し,PCRによるintronの分布を34株で調べた.結果はintron-F, G, Hが全被検菌に其々88%,12%,18%の割合で存在した。多くの中国株はintron-Fのみの挿入が,またブラジルの2菌株はintron-F, G, Hの3sitesにおける挿入が特徴的であった。cDNAのRT-PCRでintron-F, Gはself-splicing group I intronであり,推定2次構造および系統解析からintron-F, Gが共にsubgroup IC1と同定した.Intron-Hは未確認である.2 sitesはE.coliの1043,1980に相当し,共に未報告siteであり、興味が持たれる結果となった。(4)今後、菌株を増やした(1)(2)(3)の統合解析と,患者の臨床背景,自然界株の生息環境等の関連性について検討したい。また、近縁菌P.americanaは解析中である。