HPLCによる視床下部のアシルCoAの個別定量

肥満・糖尿病の原因として糖・脂質代謝異常があげられる。そこで、我々は、肥満・糖尿病を研究する上で、基本的な実験である糖・脂質代謝の測定方法の開発を行っている。今までにnon-RI2-デオキシグルコースを用いるグルコース利用速度測定法の開発(Anal.Biochem.2011)や、脂肪酸代謝測定方法の開発を行なった。本年は、組織中のアシルCoAを個別に定量する測定法の開発を行なった。その中で特にパルミトイル-CoA(飽和脂肪酸)の個別定量を検討した。カラムは、2-(2-pyridyl)ethyl-functionalized silica gelによるイオン交換カラムを用い、添加溶剤のpH変化により抽出した。方法は、マウス肝臓を脂溶性溶剤(pH6)でホモジナイズし、ホモジナイズ溶液をカラムに添加、未吸着分を洗浄(pH3-4)後、溶出液(pH6-7)で溶出した。はじめにマウス肝臓からのパルミトイル-CoA抽出、定量条件を検討した。パルミトイル-CoAのカラム吸着率を調べた。既知量のRI標識パルミトイル-CoAをカラムに添加し、抽出されたRI量を測定した。添加量の70-90%が、カラムに吸着でき、溶出できた。この時カラム未吸着分は、再度カラムに添加したが吸着されなかったことから、添加溶液中のほとんどのパルミトイル-CoAがゲルに吸着したと考える。次に既知量のRI標識パルミトイル-CoAを肝臓ホモジナイズ溶液に加え、測定した。同様の結果が得られた。しかし、溶出において1回の溶出で吸着量の30%くらいしか溶出できず、完全に回収するには3回以上の溶出操作を行なっている。現在、溶出条件の検討と溶出液の酵素法による定量を検討している。そして絶食や過栄養食を与えたマウス肝臓や脳のパルミトイルCoAの変化量測定に利用したい。

肥満・糖尿病の原因として糖・脂質代謝異常があげられる。そこで、我々は、肥満・糖尿病を研究する上で、基本的な実験である糖・脂質代謝の測定方法の開発を行っている。今までにnon-RI2-デオキシグルコースを用いるグルコース利用速度測定法の開発(Anal.Biochem.2011)や、脂肪酸代謝測定方法の開発を行なった。本年は、組織中のアシルCoAを個別に定量する測定法の開発を行なった。その中で特にパルミトイル-CoA(飽和脂肪酸)の個別定量を検討した。カラムは、2-(2-pyridyl)ethyl-functionalized silica gelによるイオン交換カラムを用い、添加溶剤のpH変化により抽出した。方法は、マウス肝臓を脂溶性溶剤(pH6)でホモジナイズし、ホモジナイズ溶液をカラムに添加、未吸着分を洗浄(pH3-4)後、溶出液(pH6-7)で溶出した。はじめにマウス肝臓からのパルミトイル-CoA抽出、定量条件を検討した。パルミトイル-CoAのカラム吸着率を調べた。既知量のRI標識パルミトイル-CoAをカラムに添加し、抽出されたRI量を測定した。添加量の70-90%が、カラムに吸着でき、溶出できた。この時カラム未吸着分は、再度カラムに添加したが吸着されなかったことから、添加溶液中のほとんどのパルミトイル-CoAがゲルに吸着したと考える。次に既知量のRI標識パルミトイル-CoAを肝臓ホモジナイズ溶液に加え、測定した。同様の結果が得られた。しかし、溶出において1回の溶出で吸着量の30%くらいしか溶出できず、完全に回収するには3回以上の溶出操作を行なっている。現在、溶出条件の検討と溶出液の酵素法による定量を検討している。そして絶食や過栄養食を与えたマウス肝臓や脳のパルミトイルCoAの変化量測定に利用したい。