Dicer-floxマウスを用いたiPS細胞におけるmicroRNAの役割の解析

内容:Dicerを欠損可能なiPS細胞の樹立のために、Dicer-floxマウスの尻尾の線維芽細胞を培養し、そこにOxt3/4,Sox2,Klf4,c-mycをレトロウイルスにて発現させ、iPS株を樹立した。一方、Dicer-floxがホモでRosaCreERT2をヘテロでもつマウスを準備し、ここからも同様の方法でiPS細胞を樹立した。これらのiPS細胞について、未分化マーカーを免療染色やRT-PCRで、増殖をBrdUの取り込みなどで検討し、通常のiPS細胞と未分化状態における性状がかわらないことを確認した。さらにDicerを欠失させるため、Creをトランスフェクション、あるいはタモキシフェンの投与にて発現させ、Dicerが欠失することを確認している。次にこれらの細胞にmiRNAを発現させるため、様々な異なるタイプのmiRNA発現プラスミドを作成し、iPSへのトランスフェクションあるいはレトロウイルスの形にしてインフェクションを行い、培養し、miRNAが過剰発現がされるかどうかqRT-PCRを用いて検討を加えた。ウイルス、トランスフェクションいずれもあまり効率の良い過剰発現には至らず、また結果も不安定で、miRNAの過剰発現の安定した系の開発が技術的な課題として残った。意義、重要性:しかしながら、本研究で樹立したこれらのiPS細胞は、Dicerの必要性の検討のみならず、miRNAのiPSの未分化性維持、分化過程における役割を検討するためにきわめて有用なツールとなることが期待される。

内容:Dicerを欠損可能なiPS細胞の樹立のために、Dicer-floxマウスの尻尾の線維芽細胞を培養し、そこにOxt3/4,Sox2,Klf4,c-mycをレトロウイルスにて発現させ、iPS株を樹立した。一方、Dicer-floxがホモでRosaCreERT2をヘテロでもつマウスを準備し、ここからも同様の方法でiPS細胞を樹立した。これらのiPS細胞について、未分化マーカーを免療染色やRT-PCRで、増殖をBrdUの取り込みなどで検討し、通常のiPS細胞と未分化状態における性状がかわらないことを確認した。さらにDicerを欠失させるため、Creをトランスフェクション、あるいはタモキシフェンの投与にて発現させ、Dicerが欠失することを確認している。次にこれらの細胞にmiRNAを発現させるため、様々な異なるタイプのmiRNA発現プラスミドを作成し、iPSへのトランスフェクションあるいはレトロウイルスの形にしてインフェクションを行い、培養し、miRNAが過剰発現がされるかどうかqRT-PCRを用いて検討を加えた。ウイルス、トランスフェクションいずれもあまり効率の良い過剰発現には至らず、また結果も不安定で、miRNAの過剰発現の安定した系の開発が技術的な課題として残った。意義、重要性:しかしながら、本研究で樹立したこれらのiPS細胞は、Dicerの必要性の検討のみならず、miRNAのiPSの未分化性維持、分化過程における役割を検討するためにきわめて有用なツールとなることが期待される。