網膜発生過程におけるＨ３Ｋ２７メチル化関連酵素の標的特異性決定メカニズムの解析

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本研究では、ヒストンH3K27のメチル化酵素、脱メチル化酵素であるEzh2, Jmjd3に会合する蛋白質、RNAについてクローニングし、その網膜内ヒストンH3K27me3における役割について明らかにすることを目的とした。まず、市販の抗体で免疫沈降、Western blotが可能であるかどうかマウス網膜を用いて検討をおこなったが、いずれも可能な抗体はみいだされなかった。このため、HAタグを添付したこれらの遺伝子のコンストラクトを作製した。このコンストラクトが酵素活性を保持していることを確認するためにマウス網膜器官培養に発現させ、これまで確認済みであるフェノタイプが再現されることを確認した。詳細な検討によって、過剰発現の効果から、あらたなH3K27me3の役割があきらかになった。さらにHAタグ付きコンストラクトを網膜器官培養で過剰発現させ、HA抗体をもちいて免疫沈降が可能であることを確認した。計画されている会合蛋白質との共沈実験の前に、ChIP-qPCRによる標的遺伝子座の決定を試みた。qPCRはシグナルが弱く、免疫沈降の効率が悪いことが予測され、この条件をかえつつ、一方でmyc tagのコンストラクトも構築し同様の検討を行った。ChIP-qPCRではあらたな標的遺伝子の候補が複数見いだされた。続いて、これらのコンストラクトを用いて、共沈実験の条件検討も行った。マウス網膜サンプルでおこなうため、スケールの拡大が困難で、小さなスケールでの特異的バンドの検出をさまざまな条件で試みたが現在までのところ、クローニングに適した特異的バンドを検出することができなかった。