虚血誘導性神経幹細胞と血管内皮細胞の共培養法の応用

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目的:虚血負荷による神経幹細胞(induced-Neural Stem/Progenitor Cells : iNSPC)の増殖・維持に血管内皮細胞との共培養が有効であることがわかったが、その増殖には接着系分子が関与していると考えられている。本実験では、血管内皮細胞によるiNSPC増殖に関与する因子を検索することを目的とする。方法:GFP陽性のiNSPCをGFP-トランスジェニックマウスの脳梗塞後の組織から作製し、RFP陽性血管内皮細胞はレンチウィルスベクターを用いて作製し、以下の実験を行った。まず、GFP-iNsPcとRFP-血管内皮細胞の接着共培養を行い、iNsPc増殖に最も適した培養条件を決定し、その条件で、1.iNsPcの単培養、2,iNsPCと血管内皮細胞の共培養、3.血管内皮細胞の単培養を行った。培養細胞をプレートから剥がし、セルソーター(BD FACSAria)を用いてGFP-iNSPCとRFP-血管内皮細胞の回収を行い、単培養のiNsPCと共培養のiNsPC、血管内皮細胞の回収細胞からRNAやタンパクを抽出後、細胞変化(特性)をDNAチップにより網羅的に検討するとともに、PCRやWestern blotにより検討を行った。結果:虚血負荷をかけた大脳皮質の梗塞組織を血管内皮細胞と共培養したiNspcと、単培養したiNSPCをそれぞれセルソーターにて回収しgene tipにて解析したところ、共培養、単培養どちらでも神経系マーカー以外に、α-smooth muscle actin(αSMA)やPDGFRβ、CD146などの血管周皮細胞マーカーやVE-Cadherin(CDH5)、CD31など、種々の血管系マーカーの発現も見られたが、共培養したiNSPCではNestinやPDGFRα、Tbr-2などの発現が増加し、神経幹細胞としての特性が亢進していることがわかった。考察1本実験により、iNSPCが神経系マーカー以外に血管系マーカーも強く発現していることが示唆された。このことは、iNSPCを脳修復Assay系として応用する上で極めて重要なことと思われる。今後、このiNSPCが神経系だけでなく血管系にも分化するかどうか検討し、その安定した分化誘導法の確立を行いたいと考えている。