虚血誘導性神経幹細胞を用いた共培養法の検討

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目的:虚血負荷による神経幹細胞(induced-Neural Stem/Progenitor Cells:iNSPC)の培養を浮遊系や接着系など様々な条件下で行い、血管内皮細胞やアストロサイト、ミクログリア、Pericyteなどのフィーダー細胞との共培養に最も適した培養法を探索することを目的とする。方法;再現性の良いCB17マウスの脳梗塞モデル(J Exp Stroke Transl Med 2010;3:28)を用い、脳梗塞後の組織からiNSPCを抽出し、(1)ニューロスフィア法で浮遊系培養を、(2)Poly-D-Lysineコーティングで接着培養を行い、細胞増殖を検討した。さらに接着系培養では血管内皮細胞との共培養を行った。iNSPCは高濃度の血清存在下ではGFAP陽性のグリア細胞に分化するため、また共培養細胞によっては血清非存在下では生存できないため、iNSPCが幹細胞としての特性を保ち、かつ神経細胞に分化できる至適な培養液の条件を探索する目的で、成長因子や血清の濃度を検討した。さらに、培養神経幹細胞の幹細胞関連遺伝子発現をGene tipやPCR、免疫組織化学、Western blotなどにより検討を行った。結果:虚血負荷をかけた大脳皮質の梗塞組織を浮遊系、接着系に培養したところ、浮遊系に比べ接着系のほうがiNSPCの増殖が見られた。さらにフィーダー細胞との共培養では、血管内皮細胞と共培養により増殖が確認されたが、共培養の条件としては、2%血清添加がiNSPCと血管内皮細胞相方の維持に至適条件と考えられた。共培養下でのiNSPCと単独培養下での神経幹細胞の発現蛋白をGene tipとPCRで観察したが、血管内皮細胞との共培養により、iNSPCの接着分子が高発現していることを確認した。考察:本実験により、虚血負荷による神経幹細胞の増殖・維持に血管内皮細胞との共培養が有効で、その増殖には接着系分子が関与することが示唆された。今後、血管内皮細胞によるiNSPC増殖に関与する因子の同定を行いたいと考えている。