制御性T細胞に発現する転写因子FOXP3の機能を制御する抗体の作成と腫瘍への応用

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【意義、目的】まず、FOXP3と特異的に反応するモノクローナル抗体を得て、組み換えDNA技術によるCD25特異抗体とのBi-specific抗体を作成、反応した抗CD25抗体の細胞内取り込みとともに、細胞内のFOXP3と反応することによってその機能を阻害することを目的とした。また、この抗体遺伝子の動物細胞内発現コンストラクトを作成、抗CD25抗体を用いてTreg細胞に特異的に導入、発現させ、その機能を制御する。最終的には、それらのうち、いずれかの方法により抗腫瘍免疫抑制を阻止することを目的とした。【結果】実施計画に基づき、抗FOXP3モノクローナル抗体のFab部分をコードする遺伝子をクローニング、動物細胞内発現コンストラクトを作成、動物細胞において発現を確認した。詳細は下記とする。・ハイブリドーマの産生する抗体のアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサにより決定し、抗体遺伝子クローニングのためのPCR用プライマーを設計した。・ハイブリドーマによりRNAを分離し、RT-PCR法により抗体遺伝子の増幅を行った。・得られた遺伝子を基に単鎖抗体を発現するベクターを構築した。ベクターはpcDNA3.1(+)を用いた。DNA組み換え実験は、愛知医科大学病院内の許可を得た実験室にて行った。・構築したマウスFlagタグ付き抗FoxP3抗体発現ベクターを、P3-X63-Ag8.653(マウスミエローマ細胞)とCHO-K1(Chinese hamster Ovary)へFuGENE[○!R]6Transfection Reagentを使用し遺伝子導入した。・G418を用いて抗FoxP3抗体発現株を選択し、安定発現株を作製した。・産生された抗体について、抗Flag抗体を用いたWesternBlottingおよびハイブリドーマ作製時に使用したペプチドFO-1を用いた肌ISAにて抗体の有無、活性を確認した。タンパク抗原を認めたが、抗体活性を認めなかった。