制御性T細胞に発現する転写因子FOXP3の機能を制御する抗体の作成と腫瘍への応用

控制调节性 T 细胞中表达的转录因子 FOXP3 功能的抗体的创建及其在肿瘤中的应用

• 批准号: 24931008
• 负责人: 柏木 隆宏
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Aichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24931008/
• 关键词: 免疫治療; FoxP3; scFV

【意義、目的】まず、FOXP3と特異的に反応するモノクローナル抗体を得て、組み換えDNA技術によるCD25特異抗体とのBi-specific抗体を作成、反応した抗CD25抗体の細胞内取り込みとともに、細胞内のFOXP3と反応することによってその機能を阻害することを目的とした。また、この抗体遺伝子の動物細胞内発現コンストラクトを作成、抗CD25抗体を用いてTreg細胞に特異的に導入、発現させ、その機能を制御する。最終的には、それらのうち、いずれかの方法により抗腫瘍免疫抑制を阻止することを目的とした。【結果】実施計画に基づき、抗FOXP3モノクローナル抗体のFab部分をコードする遺伝子をクローニング、動物細胞内発現コンストラクトを作成、動物細胞において発現を確認した。詳細は下記とする。・ハイブリドーマの産生する抗体のアミノ酸配列をアミノ酸シーケンサにより決定し、抗体遺伝子クローニングのためのPCR用プライマーを設計した。・ハイブリドーマによりRNAを分離し、RT-PCR法により抗体遺伝子の増幅を行った。・得られた遺伝子を基に単鎖抗体を発現するベクターを構築した。ベクターはpcDNA3.1(+)を用いた。DNA組み換え実験は、愛知医科大学病院内の許可を得た実験室にて行った。・構築したマウスFlagタグ付き抗FoxP3抗体発現ベクターを、P3-X63-Ag8.653(マウスミエローマ細胞)とCHO-K1(Chinese hamster Ovary)へFuGENE[○!R]6Transfection Reagentを使用し遺伝子導入した。・G418を用いて抗FoxP3抗体発現株を選択し、安定発現株を作製した。・産生された抗体について、抗Flag抗体を用いたWesternBlottingおよびハイブリドーマ作製時に使用したペプチドFO-1を用いた肌ISAにて抗体の有無、活性を確認した。タンパク抗原を認めたが、抗体活性を認めなかった。

[Significance, purpose] まず, FOXP3-specific にanti-するモノクローナルantibody を得て, みchangeえDNA technology によるCD25-specific antibody とのBi-specifi c Antibody を preparation, anti-CD25 antibody の intracellular extraction り込みとともに, intracellularのFOXP3's anti-reflection function is the purpose of the game. The anti-CD25 antibody is produced by using the また and このantibodies that are expressed in animal cells, and the anti-CD25 antibody is specifically introduced into the いてTreg cells. The ultimate には, それらのうち, いずれかの method によりanti-tumor immunosuppression をblock することをpurpose とした. 【Result】The Fab part of the anti-FOXP3 モノクローナルantibody をコードする伝をクローニング, コンストラクトを in animal cells, において発 in animal cells, confirmed. Please note the details below.・ハイブリドーマのするAntibody のアミノacid ligation をアミノ acid シーケンサによりdetermination, antibody クローニングのためのPCR design using プライマーを.・Hybrid RNA isolation and RT-PCR antibody isolation and amplification.・Get the られた弝子をbased に単Ab を発行するベクターをconstruct した.ベクターはpcDNA3.1(+)いた. The DNA group was exchanged and the laboratory was approved by the Aichi Medical University Hospital.・Constructed したマウスFlagタグきanti-FoxP3 antibody 発成ベクターを, P3-X63-Ag8.653 (マウスミエローマcell) and CHO-K1 (Chinese hamster Ovary)へFuGENE[○!R]6Transfection ReagentをUse the し弝子 imported した.・G418 is produced by using the anti-FoxP3 antibodies of the selected and stable anti-FoxP3 strains.・Production of されたantibody について, anti-Flag antibody を use いたWestern Blotting およびハイDuring the production of ブリドーマ, したペプチドFO-1 was used and the presence and activity of the いた muscle ISA was confirmed by the antibody.タンパクAntigen is recognized and antibody activity is recognized.