生細胞内での量子ドットによるタンパク質特異的蛍光標識法の開発

开发活细胞中使用量子点的蛋白质特异性荧光标记方法

• 批准号: 25921007
• 负责人: 髙橋 泰人
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25921007/
• 关键词: 大腸菌; 量子ドット; 蛍光標識

○研究目的本研究の目的は、大腸菌を対象として、その細胞内でタンパク質を特異的に量子ドットで標識する方法を確立することである。○研究方法本研究では量子ドットを大腸菌体内で合成する方法を用いて、標的タンパク質の特異的標識を試みた。標的タンパク質には大腸菌のべん毛モータータンパク質の一つであるFliNを用いた。量子ドットの前駆体となるペプチド(CDS7)をFliNのN末端側に付加するようプラスミドベクターの配列をデザインし、このプラスミドをFliN欠損株に形質転換した。この菌体に発現誘導物質を加えて融合タンパク質を発現させ、カドミウムと硫黄を加え培養することで、菌体内での合成反応を行った。融合タンパク質の発現確認はテザードセル法とWestern blotting法を用いて行い、大腸菌体内での量子ドット合成及び特異的標識の確認は蛍光顕微鏡での観察により行った。○研究成果カドミウムの添加量が多くなるにつれ、大腸菌の増殖能及び運動能の低下が見られたため、観察可能な程度の運動能が保たれていた0.3mMの条件下で実験を行うた。405nmと488nmの励起光を用いて蛍光顕微鏡で観察したところ、どちらの条件でも蛍光の輝点は観察されたが、大腸菌の回転中心に輝点をもつもの(蛍光標識されたFliNがモーターに組み込まれているもの)は見当たらなかった。また、western blottingにおいても単量体のCDS7-FIiN以外の顕著なバンドを検出することはできなかった。以上のことから、特異的に蛍光標識されたタンパク質の存在は確認できなかった。しかし、大腸菌の運動能を保ちながら菌体内で蛍光物質を合成させるということには成功したので、実験方法の改善及び最適化を図ることにより、今後の応用が期待できる。

○研究目标本研究的目的是建立一种在大肠杆菌中特异性标记蛋白质的方法。 ○在这项研究中，尝试使用一种合成大肠杆菌细胞内量子点的方法对靶蛋白进行特异性标记。 Flin是大肠杆菌的鞭毛运动蛋白之一，用作靶蛋白。设计质粒载体的序列是为了在FLIN的N末端添加前体肽（CDS7），并将质粒转化为FLIN缺陷型菌株。将表达诱导剂添加到细菌中以表达融合蛋白，并将镉和硫添加到培养物中以在细菌中进行合成反应。使用链状细胞法和蛋白质印迹法证实了融合蛋白的表达，并在荧光显微镜下观察确认了大肠杆菌细胞中的量子点合成和特定的标记。 ○研究结果：随着镉的增加量增加，大肠杆菌的生长和运动降低，实验是在0.3 mm的情况下进行的，在维持可观察到的运动性的情况下。当使用荧光显微镜使用405 nm和488 nm的荧光显微镜观察时，在两种条件下都观察到荧光明亮的斑点，但是在大肠杆菌的旋转中心（那些荧光标记的荧光丝（荧光标记的flin）（那些在荧光中标记为荧光丝掺入了运动中）。此外，即使在蛋白质印迹中，除了单体CDS7-FIIN之外，也没有其他明显的带。从以上，无法确认特异性荧光标记的蛋白质的存在。但是，由于它已经成功地合成细胞内的荧光物质，同时维持大肠杆菌的运动性，因此可以通过改善和优化实验方法来期望未来的应用。