金コロイド標識骨基質タンパク分子のX線マッピングを用いた局在解析法の開発

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石灰化組織の発生過程では、細胞外基質タンパクがまず土台を作り、その土台の上にリン酸カルシウムの結晶が集積して硬くなると考えられている。この現象を詳細に解析するためには、基質タンパク分子とカルシウムやリン等の元素との空間的な位置関係を同時に可視化し解析できる研究手法が求められる。本研究計画はその方法論として、エネルギー分散型分光法(EDX)を用いてカルシウムやリンと、基質タンパク分子に免疫染色で標識した金を同時に検出することを検討しようとするものである。胎生16、18、20日齢、生後1週齢、6週齢のラット頭蓋骨および生後2週齢、6週齢のラット膝関節を4%パラホルムアルデヒドで固定し凍結包埋、または10%EDTA脱灰後にパラフィン包埋した。凍結切片作製後の凍結包埋試料の断面をEDXでカルシウム、リン、金の元素の局在について検討し、凍結切片およびパラフィン切片を抗II型コラーゲン抗体または抗X型コラーゲン抗体を一次抗体とし、蛍光標識二次抗体または金コロイド標識二次抗体を用いて免疫染色し検討した。EDXでは、CaとPの元素分布は骨組織に一致して見られたが、Auは生体の骨組織には分布しないことを確認した。蛍光標識二次抗体を用いた免疫染色では、II型コラーゲンが軟骨全体に、X型コラーゲンが肥大軟骨に認められた。一方、金コロイド標識二次抗体を用いた免疫染色では、銀増感を施した試料でも金粒子が検出できず、方法論の改良が必要と思われた。なお、平成25年12月から平成26年4月まで研究代表者が病気休暇を取得し研究に遅れが生じ、研究費の一部を繰り越し平成26年度に補助事業を完了した。