病態時ヒト中枢神経系におけるシトクロムＰ４５０の機能解析研究

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【研究目的】本研究では、in vitroにおける中枢神経系薬物代謝モデルの構築を目的とし、ヒト中枢神経系モデル細胞を用いて、中枢神経系病態時におけるシトクロムP450(CYP)分子種の機能解析研究を行った。今回、中枢神経障害を引き起こすことが報告されている小胞体ストレス、及び酸化ストレス負荷条件下を病態モデルと位置づけ検討を実施した。【研究方法】1、ヒト脳由来細胞の培養方法本研究では、ニューロンのモデル細胞としてヒト脳由来神経芽腫細胞SH-SY5Y、アストロサイトのモデル細胞としてヒト神経膠芽腫瘍細胞U-87MGを使用した。また、以下の実験には、DMEM/F12+10%FBSを用い、Incubator(37℃、5%CO_2)下で培養した各種細胞を使用した。2、病態時におけるヒト脳由来細胞の薬物代謝酵素の発現変動解析小胞体ストレス誘発剤であるツニカマイシン、酸化ストレス誘発剤である6-ヒドロキシドパミンがヒト脳由来細胞に発現するCYP分子種に与える影響について解析を行った。各種濃度のツニカマイシン(0μg/ml-10μg/ml)、6-ヒドロキシドパミン(0μM-30μM)を無血清培地下でSH-SY5Y細胞、及びU-87MG細胞に暴露し、24時間後のRNAを抽出した。その後逆転写反応、cDNA合成を行った後にリアルタイムPCRを行い、CYP分子種のmRNA発現量を測定した。また、予備的検討よりヒト脳由来細胞で高い発現量が認められたCYP分子種(CYP1A1、1B1、2B6、2E1、2J2、46A1)に焦点を当てて検討を行った。【研究成果】酸化ストレスにより、U-87MG細胞におけるCYP1B1のmRNA発現量はコントロール群と比較して有意に惹起された。SH-SY5Y細胞においては検討した暴露条件下ではCYP分子種のmRNA発現量に変化は認められなかった。一方、小胞体ストレスにより、SH-SY5Y細胞におけるCYP2E1のmRNA発現量はコントロール群と比較して有意に抑制された。上記結果より、酸化ストレス下における中枢神経系細胞でのCYP1B1mRNA発現量、及び小胞体ストレス下におけるCYP2E1mRNA発現量が変化する可能性が示唆された。さらに、ニューロン及びアストロサイトにおいて、酸化ストレスによるCYP1B1の発現応答性が異なる可能性が示唆された。