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ゲノム刷り込み遺伝子Ｉｇｆ２ｒのＤＮＡメチル化誘導機構の解明

阐明基因组印迹基因Igf2r的DNA甲基化诱导机制

基本信息

批准号：
26930027
负责人：
八木ひとみ
金额：
$ 0.38万
依托单位：
Saga University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26930027/
关键词：
刷り込み遺伝子 DNAメチル化 shRNAライブラリー

项目摘要

刷り込み遺伝子の発現を制御するDNAメチル化がどのような機序で誘導されるのかということを明らかにするため、shRNAライブラリーを用いたスクリーニング系の作成を試みた。マウスES細胞は、分化誘導に伴い正常なDNAメチル化が起こり、Igf2r遺伝子が両アレル発現から母性片アレル発現となる。shRNAライブラリーを感染させ、特定の遺伝子の機能が低下するとDNAメチル化が異常になり、Igf2rが父性アレルから発現することが期待できる。このため、Igf2rの父性アレルにマーカー遺伝子を挿入することで、Igf2rの父性アレル発現をマーカーの発現で同定できる細胞を作製した。当初、マーカーとしてVenusを使ったが、shRNAライブラリーに使用されているベクターを感染させるだけでVenus陽性となり、バックグラウンドが高くなるため真のVenus陽性細胞の選別が困難であることがわかった。そこで、Venusの代わりに3xFLAGを挿入した細胞を作製した。ポジティブコントロールとしてDnmt1に対するshRNA(shDnmt1)を感染させ、抗FLAG抗体(一次抗体)とAlexa Fluor® 647 Conjugated抗マウスIgG抗体(二次抗体)を用いてフローサイトメーターで解析したところ、バックグランドが十分に低くなり、真の陽性細胞の選別が効率良くできることがわかった。今後は、2種類のshRNAライブラリー(それぞれ約1万個の遺伝子を抑制することができる約2万5千種類のshRNA配列を保持する)を独立に感染させ、陽性細胞を選別し、次世代シークエンサーでshRNAの配列を解析することでメチル化制御因子の同定につなげる予定である。

The gene expression of the gene is controlled by DNA sequencing. The gene expression of the gene is controlled by DNA sequencing. ES cells are induced to differentiate into normal DNA, Igf2r, and maternal cells. shRNA infection, decreased function of specific genes, abnormal DNA mutation, and paternity of Igf2r are expected. The gene expression of Igf2r and Igf2r is determined by the cell function. In the beginning, Venus was infected with shRNA, and it was difficult to select true Venus positive cells. The 3xFLAG is the only way to control Venus. shRNA(shDnmt1) infection, anti-FLAG antibody (primary antibody) and Alexa Fluor® 647 Conjugated anti-FLAG IgG antibody (secondary antibody) were used to analyze and identify very low and positive cells. In the future, two types of shRNA will be infected independently (about 10,000 shRNA genes will be suppressed, and about 25,000 shRNA sequences will be maintained), and positive cells will be selected and shRNA sequences will be analyzed in the next generation.