ゲノム刷り込み遺伝子Ｉｇｆ２ｒのＤＮＡメチル化誘導機構の解明

刷り込み遺伝子の発現を制御するDNAメチル化がどのような機序で誘導されるのかということを明らかにするため、shRNAライブラリーを用いたスクリーニング系の作成を試みた。マウスES細胞は、分化誘導に伴い正常なDNAメチル化が起こり、Igf2r遺伝子が両アレル発現から母性片アレル発現となる。shRNAライブラリーを感染させ、特定の遺伝子の機能が低下するとDNAメチル化が異常になり、Igf2rが父性アレルから発現することが期待できる。このため、Igf2rの父性アレルにマーカー遺伝子を挿入することで、Igf2rの父性アレル発現をマーカーの発現で同定できる細胞を作製した。当初、マーカーとしてVenusを使ったが、shRNAライブラリーに使用されているベクターを感染させるだけでVenus陽性となり、バックグラウンドが高くなるため真のVenus陽性細胞の選別が困難であることがわかった。そこで、Venusの代わりに3xFLAGを挿入した細胞を作製した。ポジティブコントロールとしてDnmt1に対するshRNA(shDnmt1)を感染させ、抗FLAG抗体(一次抗体)とAlexa Fluor® 647 Conjugated抗マウスIgG抗体(二次抗体)を用いてフローサイトメーターで解析したところ、バックグランドが十分に低くなり、真の陽性細胞の選別が効率良くできることがわかった。今後は、2種類のshRNAライブラリー(それぞれ約1万個の遺伝子を抑制することができる約2万5千種類のshRNA配列を保持する)を独立に感染させ、陽性細胞を選別し、次世代シークエンサーでshRNAの配列を解析することでメチル化制御因子の同定につなげる予定である。

刷り込み遺伝子の発現を制御するDNAメチル化がどのような機序で誘導されるのかということを明らかにするため、shRNAライブラリーを用いたスクリーニング系の作成を試みた。マウスES細胞は、分化誘導に伴い正常なDNAメチル化が起こり、Igf2r遺伝子が両アレル発現から母性片アレル発現となる。shRNAライブラリーを感染させ、特定の遺伝子の機能が低下するとDNAメチル化が異常になり、Igf2rが父性アレルから発現することが期待できる。このため、Igf2rの父性アレルにマーカー遺伝子を挿入することで、Igf2rの父性アレル発現をマーカーの発現で同定できる細胞を作製した。当初、マーカーとしてVenusを使ったが、shRNAライブラリーに使用されているベクターを感染させるだけでVenus陽性となり、バックグラウンドが高くなるため真のVenus陽性細胞の選別が困難であることがわかった。そこで、Venusの代わりに3xFLAGを挿入した細胞を作製した。ポジティブコントロールとしてDnmt1に対するshRNA(shDnmt1)を感染させ、抗FLAG抗体(一次抗体)とAlexa Fluor® 647 Conjugated抗マウスIgG抗体(二次抗体)を用いてフローサイトメーターで解析したところ、バックグランドが十分に低くなり、真の陽性細胞の選別が効率良くできることがわかった。今後は、2種類のshRNAライブラリー(それぞれ約1万個の遺伝子を抑制することができる約2万5千種類のshRNA配列を保持する)を独立に感染させ、陽性細胞を選別し、次世代シークエンサーでshRNAの配列を解析することでメチル化制御因子の同定につなげる予定である。