O-2A前駆細胞由来のドパミン神経細胞アポトーシス抑制因子の同定

源自 O-2A 祖细胞的多巴胺能神经元凋亡抑制剂的鉴定

• 批准号: 08770456
• 负责人: 竹島 多賀夫
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770456/
• 关键词: アポトーシス; ドパミン; differentail display; O-2A前駆細胞

中脳初代培養血清奪取モデルによるアポトーシスを検討し,O-2A前駆細胞由来のアポトーシス抑制因子探索を行った.血清奪取により,死細胞は核の濃縮等アポトーシスの特徴を呈し,また,抽出したDNAは非ランダム断片化(laddering)していた.TdTによるin situ DNA断端標織によりアポトーシス細胞数を定量した.線条体神経,大脳皮質神経との比較では,中脳神経は他の神経細胞より12時間早くアポトーシスを起こしていた.TH染色とTdTによるDNA断端標織を同時に施行することによりドパミン神経のアポトーシスを確認した.calcein AM/ethidium homodimerを用いたviability assayとin situ DNA標識による定量の比較より,血清奪取モデルにおける神経細胞死は大部分がアポトーシスであることを確認した.中脳アポトーシスはoligodendrocyte type2 astrocyte(O-2A)前駆細胞及びグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)により抑制された.O-2A細胞,オリゴデンドロサイト,および,GDNF産生細胞(B49不死化細胞)を大量培養しmRNAを抽出した.精製したmRNAをdegenerate 6-mer oligonucleotideを用いて逆転写を行い,cDNAを得た後,複数のprimerの組み合わせにより複数のPCRを行いdifferential displayを行った.O-2A前駆細胞に特異的に出現するバンド,すなわち新しいアポトーシス抑制因子の可能性があるバンドが複数得られた.クローニング効率を上げるため,O-2A前駆細胞培養のバッチ間によるアポトーシス抑制効果の作用強度の違いとmRNAの発現強度を比較検討中である.新しいアポトーシス抑制因子のfragmentである可能性が高いバンドからクローニングを行い,塩基配列を決定し全長の塩基配列を探索する予定である.

To explore the origin of O-2A precursor cells and their inhibitory factors. Serum capture, concentration of dead cells, etc., were characterized by DNA fragmentation.TdT was used to quantify the number of dead cells. A comparison of striated neurons and cortical neurons was performed simultaneously with TdT staining and DNA termination labeling to confirm the quantitative comparison of calcein AM/ethidium homodimer with viability assay in situ DNA labeling. The serum captures the nerve cell to die most to lose the ability to identify. The expression of oligodendrocyte type2 astrocyte(O-2A) was inhibited by GDNF in O-2A cells and GDNF producing cells (B49). After purification of mRNA and degeneration of 6-mer oligonucleotide,cDNA was obtained, multiple primers were assembled, multiple PCRs were performed, and differential display was performed.O-2A precursor cells were found to be unique to the gene, and the possibility of new gene suppression factors was determined. A comparative study of the inhibitory effects and mRNA expression in O-2A precursor cell cultures was conducted. The probability of fragment of new type of inhibition factor is high, and the base alignment is determined.

项目成果

Takeshima,T.: "Apoptosis and dopaminergic neurotrophic factors(DNTFs)in rat mesencephalic dopaminergic neuronal cultures." Soc.Neursci.Abs.22. 994-994 (1996)

Takeshima,T.：“大鼠中脑多巴胺能神经元培养物中的细胞凋亡和多巴胺能神经营养因子（DNTF）。”

Commissiong,J.W.: "Specific,increased survival of dopaminergic and non-dopaminergic neurons in a mesencephalic cell culture,by inhibitors of monoamine oxidase B." Soc.Neurosci.Abs.22. 741-741 (1996)

Commissiong，J.W.：“通过单胺氧化酶 B 抑制剂，可以提高中脑细胞培养物中多巴胺能和非多巴胺能神经元的存活率。”

Commissing,J.W.: "Effects of transforming growth factors on dopaminergic neurons in culture" Neurochem.Int.(in press).

Commmissing，J.W.：“转化生长因子对培养物中多巴胺能神经元的影响”Neurochem.Int.（印刷中）。

Takeshima,T.: "Standardized methods to bioassay neurotrophic factors for dopaminergic neurons." J.Neurosci.Meth. 67. 27-41 (1996)

Takeshima,T.：“生物测定多巴胺能神经元神经营养因子的标准化方法。”