O-2A前駆細胞,不死化中脳アストロサイト由来ドパミン神経栄養因子のクローニング

O-2A 祖细胞的克隆，永生化中脑星形胶质细胞衍生的多巴胺神经营养因子

• 批准号: 09770444
• 负责人: 竹島 多賀夫
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770444/
• 关键词: 神経栄養因子; differential display; ドパミン神経; パーキンソン病; アストロサイト; O-2A前駆細胞; グリア; 0-2A前駆細胞

Oligodendrocyte-type-2 astrocyte(O-2A)前駆細胞由来のドパミン神経栄養因子を同定するためにdifferential display(DD)法を用いて検討した.O-2A前駆細胞はラット胎生16日の線条体より我々が開発したbFGF刺激法にて純度95%のO-2A前駆細胞を得たのち,GTC法にてRNAを回収し,poly-Aカラムを用いてmRNAを精製した.オリゴデンドロサイトはO-2A前駆細胞をPDGF刺激により分化誘導して得た.I型アストロサイトは,胎生16〜18日ラット脳より中脳,線条体,大脳皮質,小脳を切り出し,血清培地で培養し振盪法により精製した.オリゴデンドロサイト,各種I型アストロサイトのmRNAをO-2A細胞と同様の方法で得た.また,培養上清のドパミン神経栄養効果をmicroisland法を用いて検討した.mRNAの逆転写により得たcDNAを6種類のプライマーセットを用いてDDを行った.O-2A前駆細胞で発現しオリゴデンドロサイトに分化すると消失するバンドで,大脳皮質I型アストロサイトでは発現していないバンドを選定した.0-2A前駆細胞条件培地のドパミン効果の培養バッチ間の差異と,各バッチより得たmRNAのDD上のバンドの強度により優先順位を付けて検討を行った.DD後回収したDNAを再度PCR増幅を行い,各バンドともサブクローニングを行い,各バンドより5〜10クローンを得た.DDの際に用いたプライマーにて,再度確認PCRを行った後,オートシーケンサにより塩基配列を決定した.合計126クローンより,11個の105bp〜497bpの候補遺伝子断片のシーケンスを得た. 11個の遺伝子断片の塩基配列をBLASTを用いて相同性検索を行った。3個の遺伝子断片は既知遺伝子の一部と完全に一致し,カリウムチャンネル,Noppl40(シャトル蛋白),リボソームRNAであった.他の8個の遺伝子断片はPex,インスリンと相同性があったが未知の塩基配列であった.現在,Nopp140のドパミン神経栄養効果,カリウムチャンネルの関与について検討している.またインスリン,Pexと相同性の高い遺伝子断片について,5'-RACE法により全長塩基配列を決定すべく検討を続けている.

The origin of oligodendrocyte-2 astrocyte(O-2A) precursor cells was studied by differential display(DD) method.O-2A precursor cells were isolated from 16-day-old line cells by bFGF stimulation method.O-2A precursor cells with purity of 95% were isolated by GTC method. RNA was recovered by GTC method. Poly-A mRNA was purified by DD method. The differentiation of O-2A cells was induced by PDGF stimulation. Type I cells were cultured by shaking method. A variety of type I gene expression vectors were obtained by the same method in O-2A cells. In addition, the microisland method was used to investigate the effects of culture supernatant on the development and differentiation of O-2A cells. The difference between the culture conditions of the cells and the results of the culture was analyzed. The mRNA was obtained from each cell. The intensity of the mRNA was determined by the preferential sequence. The PCR amplification was performed again. 5 ~ 10 minutes for each sample. Once the PCR sequence is confirmed again, the sequence is determined. In total, 11 candidate fragments from 105bp to 497bp were obtained. The 11 gene fragments were sequenced and identified by BLAST. Three fragments were identified, some of which were known to be completely identical, including Noppl 40(a protein),Noppl40(a protein). He has 8 genes, which are identical to each other. Now, the Nopp140's. The 5'-RACE method is used to determine the full length base alignment.

项目成果

Takeshima,T.,et al.: "Familial hemiplegic migraine." Intern.Med. 37. 108-109 (1998)

Takeshima,T.,et al.：“家族性偏瘫性偏头痛。”

Takashima T: "Acrophase amplitude of ambulatory blood pressure decreases in migraineurs." Headache. 37. 577-582 (1997)

Takashima T：“偏头痛患者动态血压的末期振幅降低。”

Mishima K,: "Platelet ionized magnesium,cyclic AMP, and cyclic GMP levels in migraine and tension type headache." Headache.

Mishima K，：“偏头痛和紧张型头痛中的血小板离子镁、环 AMP 和环 GMP 水平。”

Commissiong JW.: "A type-1 astrocyte cell line of mesencephalic origin(VM-CL2):Source of a potent dopaminergic neurotrophic factor." Soc.Neurosci.Abs.23. 1939-1939 (1997)

Commissiong JW.：“中脑起源的 1 型星形胶质细胞系 (VM-CL2)：强效多巴胺能神经营养因子的来源。”

37. 561-564 (1997)

37. 561-564 (1997)